几种合成食品添加剂与DNA的相互作用及其对DNA构象的影响

摘要

食品添加剂对改善食物色、香、味、形，提高食物的品质，延长食品的保存期具有重要作用，是现代食品工业的重要组成部分。近几年来，一些企业尤其是小食品作坊为了一味追求食品的形态、口感等，不按国家标准规定使用食品添加剂，以致生产出的食物不合格，对人体健康造成损害。因此，必须按照食品安全国家标准严格控制食品添加剂的加入量。DNA作为人体遗传信息的携带者，参与蛋白质及酶类的合成、复制及转录等过程。同时，DNA又是许多化学有毒害物质在细胞内的作用靶标。因此，本文以小牛胸腺DNA(ctDNA)为靶点，通过构建多种光谱学技术、化学计量学方法和分子模拟联用的方法体系，研究了麦芽酚、香兰素和乙基香兰素、过氧化苯甲酰等人工合成食品添加剂在模拟人体生理酸度(pH7．4)条件下与 ctDNA的结合模式、结合位点、结合性质及其对ctDNA构象的影响，为深入认识这些合成食品添加剂与ctDNA的作用机制和可能的毒性机理提供理论依据。
　　本文的主要研究内容及结果如下：
　　1.运用荧光光谱法紫外–可见光谱法(UV–vis)、圆二色光谱法(CD)和红外光谱法(FT–IR)联合DNA熔点和粘度测量，探测了麦芽酚(MAL)与小牛胸腺DNA(ctDNA)之间的结合性质和结合模式。实验结果表明，MAL与ctDNA的结合未引起ctDNA的熔点和粘度明显变化，NaCl浓度的增加，对MAL–ctDNA体系紫外吸收光谱无明显影响，表明二者是以沟槽方式结合且不存在静电作用。计算出的热力学参数表明，MAL与ctDNA的结合作用主要由氢键和范德华力驱动。CD和FT–IR分析表明，MAL更倾向于与ctDNA的T碱基结合，并诱导ctDNA的B型结构变得更为松散。分子模拟直观展示了MAL与ctDNA的结合模式为沟槽结合，且主要结合在ctDNA的T碱基富集区，证实了实验结果。凝胶电泳实验表明，MAL没有引起质粒DNA的明显损伤。
　　2.联合运用化学计量学多元曲线分辨–交替最小二乘法（MCR–ALS）、多种光谱技术以及分子模拟等手段，研究了香兰素(VAN)、乙基香兰素(EVA)与ctDNA的相互作用。MCR–ALS分析获得的目标组分(VAN、ctDNA和VAN–ctDNA或EVA、ctDNA和EVA–ctDNA)的纯光谱和浓度变化趋势证实了VAN和EVA分别与ctDNA形成了VAN–ctDNA和EVA–ctDNA复合物。粘度测量、熔点实验、单双链实验以及竞争实验结果表明，VAN、EVA与ctDNA的结合模式为沟槽结合。FT–IR分析以及分子模拟预测显示，VAN和EVA优先与ctDNA的T碱基结合。CD光谱和DNA裂解实验表明，VAN和EVA都引起DNA的构象变化(B构象向A构象转变)，但没有引起DNA明显的损伤。VAN、EVA与Hoechst33258–ctDNA复合物的荧光猝灭实验是静态猝灭，且氢键和范德华力为主要驱动力。
　　3.运用UV–vis、CD和 FT–IR并结合DNA熔点和粘度测量，研究了离子液体1–丁基–3–甲基咪唑氯盐(BMIM–Cl)对香兰素(VAN)、麦芽酚(MAL)与小牛胸腺DNA的相互作用的影响。结果表明，BMIM–Cl能够增加ctDNA的稳定性，但不改变其结构。在BMIM–Cl的存在下，VAN或EVA对ctDNA的熔点和粘度没有明显的影响，且单链DNA与VAN或MAL的结合常数大于双链 DNA与VAN或EVA的结合常数，表明VAN或MAL与ctDNA之间是以沟槽方式发生作用。获得的焓变、熵变值表明，氢键与范德华力是BMIM–Cl存在下VAN(MAL)与ctDNA反应过程的主要驱动力。CD和FT–IR分析表明，BMIM–Cl的存在对VAN(MAL)与ctDNA结合位点及对ctDNA构象有一定的影响。
　　4.在生理酸度条件下(pH7.4)，运用多种光谱分析方法研究了过氧化苯甲酰(BPO)与2–羟丙基–β环糊精(Hp–βCD)和小牛胸腺DNA(ctDNA)的相互作用。结果表明，Hp–βCD与BPO形成1:1的包合物，两者的包合常数为2.40×104 L·mol–1。运用MCR–ALS解析BPO与ctDNA的扩展紫外光谱矩阵，获得各反应组分(BPO、ctDNA和BPO–ctDNA)的浓度变化，从而实现了反应进程直观监控。分子模拟结果证明，BPO以嵌插方式插入DNA的碱基对。计算出的热力学参数表明，氢键和范德华力是 Hp–βCD–BPO包合物与ctDNA之间的主要驱动力。在Hp–βCD–BPO存在下，ctDNA的熔点和粘度无明显变化，KI荧光猝灭效应和Na3PO4的存在使Hp–βCD–BPO–ctDNA复合物的荧光强度发生改变，表明Hp–βCD–BPO包合物与ctDNA主要通过沟槽和静电方式结合。FT–IR和CD分析结果表明，Hp–βCD–BPO包合物主要与ctDNA的鸟嘌呤(G碱基)发生特异性结合，并引起ctDNA的B构象向A构象转变。

目录

声明

缩写符号与代号

第1章 绪论

1.1 引言

1.2 DNA的结构

1.3 小分子与DNA的相互作用

1.4 研究现状

1.5研究方法

1.6 课题来源与研究内容

第2章 麦芽酚与小牛胸腺DNA的沟槽结合作用

2.1 引言

2.2 实验部分

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

第3章 香兰素、乙基香兰素与ctDNA结合模式研究与比较

3.1 引言

3.2 实验部分

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

第4章 离子液体1–丁基–3–甲基咪唑氯盐对香兰素、麦芽酚与ctDNA相互作用的影响

4.1 引言

4.2 实验部分

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

第5章 过氧化苯甲酰与ctDNA的嵌插结合及Hp–βCD的影响

5.1 引言

5.2 实验部分

5.3 结果与讨论

5.4 本章小结

第6章 结论与展望

6.1 结论

6.2 展望

致谢

参考文献

攻读硕士期间的研究成果