贝母素乙对人结肠癌HCT-116细胞基因表达谱的影响及其自噬的研究

摘要

研究背景及目的：
　　结肠癌(colon cancer)是消化系统常见的恶性肿瘤之一，我国结肠癌的发病率逐年上升。结肠癌的治疗一般以手术治疗为主，并配合化学治疗以及靶向治疗，但患者尤其是晚期结肠癌患者的生存及预后不甚理想。中医药在结肠癌的治疗中具有一定疗效，可以通过降低结肠癌的复发转移机率，改善患者的生存质量，但临床治疗效果个体差异较大，作用机制仍有待进一步明确。在前期研究中发现，中药提取物贝母素乙（peiminine）在体外实验中能够明显抑制人结肠癌HCT-116细胞生长，因此，本研究拟继续研究贝母素乙对人结肠癌HCT-116细胞基因表达谱的影响，并观察贝母素乙对人结肠癌HCT-116细胞自噬的作用，明确该单体对人结肠癌HCT-116细胞的分子作用靶点和作用机制，为该药物的开发及临床应用提供理论依据。
　　研究方法：
　　1.采用Affymetrix公司的PrimeView?Human Gene Expression Array基因表达谱芯片探究中药提取物贝母素乙对人结肠癌HCT-116细胞基因表达谱的影响。将实验分为贝母素乙组和对照组，分别干预人结肠癌 HCT-116细胞后，提取总RNA，随后基因芯片杂交步骤按照北京博奥晶典生物技术有限公司提供的基因表达谱芯片实验操作流程进行，并进行数据处理和分析。
　　2.将稳定表达GFP-LC3的质粒成功转染至人结肠癌HCT-116细胞，用不同浓度（0uM、50uM、100uM、200uM）的贝母素乙作用该细胞，对照组用相同体积的DMSO处理，使用共聚焦显微镜观察自噬现象；将不同处理的贝母素乙作用HCT-116细胞，即5个给药浓度（0 uM，50uM，100uM，200 uM，400uM）和五个给药时长(0小时，4小时，8小时，12小时，24小时)，蛋白免疫印迹法（Western blotting）检测自噬相关蛋白的表达。
　　研究结果：
　　1.筛选出37个差异基因，贝母素乙组和对照组比较，显著上调5个，下调32个。经过GO（Go Ontology）富集分析，差异基因主要集中在生物学过程和分子功能方面，而在细胞组分方面无明显差异；在生物学过程中差异基因主要集中在热生成调控、运动行为调控、尿嘧啶核苷代谢过程、肾上腺素能受体信号通路的调控、脂肪组织代谢的调控和 G蛋白偶联受体信号通路的调控；在分子功能方面表现为肾上腺素能受体结合活性和尿嘧啶核苷磷酸化酶活性。经过KEGG富集分析，差异表达基因主要集中在药物代谢酶、嘧啶代谢、酮体合成和降解、维生素B6代谢、核糖体方面。
　　2.在共聚焦显微镜下，可以明显观察到贝母素乙组中多个明亮的绿色荧光斑点聚集成团块状，形成自噬斑，而对照组呈散点状分布，且随着贝母素乙浓度的升高，自噬细胞数量逐渐增多。蛋白免疫印迹法（Western blotting）检测，与对照组相比，200 uM和400uM的贝母素乙以及200 uM的贝母素乙处理细胞不同时长(4小时，8小时，12小时，24小时)，LC3B-II/LC3B-I比值及SQSTM1（p62）均成显著升高的趋势（P＜0.05）。
　　结论：
　　从基因层面的结果提示差异表达基因有37个，这些基因的变化均可能是贝母素乙抗肿瘤作用的靶点，主要体现在对细胞增殖、氟尿嘧啶代谢通路的影响、能量代谢、对YY1转录因子的调控四个方面。其中YY1基因的上调，共聚焦显微镜观察到自噬斑，蛋白免疫印迹法检测到自噬蛋白LC3B-II、SQSTM1（p62）的表达，均提示贝母素乙对人结肠癌 HCT-116细胞的作用与自噬相关，有利于贝母素乙药理活性的深入研究，为浙贝母抗肿瘤的临床应用提供理论依据。

目录

中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 应用基因芯片研究中药提取物贝母素乙抗肿瘤作用机制

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

第3章 探讨贝母素乙诱导人结肠癌HCT-116细胞自噬研究

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

第4章 结论与展望

4.1 结论

4.2进一步工作的方向

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述:自噬在中医药治疗大肠癌中的作用研究