肿瘤外泌体诱导巨噬细胞表型改变与其促进肿瘤生长的关系

摘要

研究背景和目的： 恶性肿瘤疯狂生长和转移的重要机理在于肿瘤细胞通过释放细胞因子和外泌体“教育”浸润到肿瘤组织中的免疫细胞，形成有利于肿瘤生长和转移的肿瘤微环境。多种免疫细胞，尤其是肿瘤相关巨噬细胞，参与肿瘤免疫抑制性微环境的形成。前期大量研究表明，肿瘤细胞通过释放细胞因子或外泌体而将肿瘤相关巨噬细胞（TAM）改变成对肿瘤生长有利的“M2”型。但是，目前尚不清楚的是：1）肿瘤细胞来源的细胞因子和外泌体是否分别诱导 TAM产生不同的表型？2）肿瘤细胞来源的外泌体诱导的巨噬细胞的表型与经典的 M2型巨噬细胞有何不同？3）肿瘤细胞来源的外泌体诱导的巨噬细胞对肿瘤生长的影响是否不同于经典的 M2型巨噬细胞？另外，前期的研究表明，肿瘤细胞产生的外泌体中含有巨噬细胞移动抑制因子（MIF），后者在外泌体诱导巨噬细胞表型变化过程中发挥重要作用。MIF具有互变异构酶活性和巯基蛋白氧化还原酶活性，而大量的研究表明，MIF的互变异构酶活性与其生物学功能有重要关系。因此，我们通过高通量筛选，已经获得 MIF互变异构酶活性的小分子抑制剂。本研究的第一部分将分析肿瘤外泌体诱导的“M2型”样的巨噬细胞与经典的M2型巨噬细胞的表型和功能差异；第二部分将分析 MIF的小分子抑制剂对肿瘤外泌体诱导的巨噬细胞表型变化的影响，为开发新型抗肿瘤药物奠定基础。 实验方法： 1、来自于小鼠骨髓的巨噬细胞（BMDM）的培养以及巨噬细胞向M1或M2型极化 2、肿瘤细胞外泌体的提取和鉴定 3、利用q-PCR和基因芯片技术研究肿瘤外泌体对巨噬细胞表型的影响 4、用4T1细胞建立小鼠乳腺癌原位模型，并采用免疫组化等技术研究肿瘤浸润的巨噬细胞的表型 5、采用流式细胞术研究肿瘤外泌体诱导的巨噬细胞与传统的M1或M2型巨噬细胞对T细胞增殖的影响 6、利用CCK-8和Boyden Chamber试剂盒研究肿瘤外泌体诱导的巨噬细胞与传统的M1或M2型巨噬细胞对肿瘤细胞增殖和迁移的影响 7、利用q-PCR等技术研究MIF的小分子抑制剂对肿瘤外泌体诱导的巨噬细胞表型变化的影响 实验结果： 1、肿瘤细胞培养上清（含细胞因子和外泌体）诱导的巨噬细胞既表达 M1的基因也表达 M2的基因，呈现 M1/M2混合型的特征。1）肿瘤细胞培养上清诱导的 M0型（未极化）巨噬细胞既表达 M1型相关基因（如 IL-1?、IL-6, iNOS）也表达 M2型基因（如 IL10、Arg-1）；2）肿瘤细胞培养上清诱导的M1型巨噬细胞既表达更高水平的M1型相关基因（如IL-1?、IL-6, iNOS），但也表达 M2型基因（如 IL10、Arg-1）；3）肿瘤细胞培养上清诱导的 M2a或M2c型巨噬细胞既表达更高水平的 M2型相关基因（如 IL10、Arg-1）,也表达高水平的M1型相关基因（如、IL-1?、IL-6, iNOS）。 2、含有外泌体和不含外泌体的肿瘤细胞培养上清对巨噬细胞表型的影响有显著性差异。含外泌体的肿瘤上清诱导 M0、M2a、M2c表达高水平的 IL10、ARG1基因，而去除外泌体后，其表达水平均有明显的下降。 3、基因芯片结果显示，肿瘤外泌体诱导的 M0型巨噬细胞既表达 M1相关基因也表达M2相关基因，提示外泌体诱导的巨噬细胞呈现M1/M2混合表型，而且不同于经典的M2a或M2c。此外，外泌体诱导的巨噬细胞中趋化因子受体CXCR4和 CX3CR1表达显著下调，提示肿瘤外泌体导致巨噬细胞趋化性下降。另外，肿瘤外泌体诱导的 M0型巨噬细胞中免疫共刺激分子 CD28表达下调，表明巨噬细胞的免疫反应性下降。 4、基因芯片结果显示，肿瘤外泌体诱导的 M1型巨噬细胞中 M2型相关基因（如、Arg-1、CD209、VEGF等）表达上调，而M1型相关基因（如CXCL9、CD86等）下调，提示肿瘤细胞外泌体诱导M1型巨噬细胞向M2型转变。但是， M1型巨噬细胞在肿瘤外泌体诱导后产生的表型既不同于M2a,也不同于M2c。 5、基因芯片结果显示，肿瘤外泌体诱导的 M2a型巨噬细胞中多种 M1相关基因（如 CCR7、CXCL9、CXCL10、IL-12、IL-1?等）表达上调，而 M2相关基因（如 CD163、CCL22等）下调，提示肿瘤细胞外泌体诱导 M2a型巨噬细胞向 M1型转变。此外，CXCR4下调提示巨噬细胞的趋化性降低，而免疫共刺激分子CD28下调提示巨噬细胞的免疫反应性下降。 6、因芯片结果显示，肿瘤外泌体诱导的M2c型巨噬细胞中多种M1和M2相关基因表达上调，提示 M2c型巨噬细胞在外泌体诱导后呈现复杂的表型。而M2相关基因（如 CD163、CCL22等）下调，提示肿瘤细胞外泌体诱导 M2c型巨噬细胞向 M1型转变。此外，CXCR4下调提示巨噬细胞的趋化性降低，而免疫共刺激分子CD28下调提示巨噬细胞的免疫反应性下降。 7、在 BALB/C小鼠原位乳腺癌的癌组织中浸润的巨噬细胞既有单纯表达CD86的 M1型，也有单纯表达 ARG1的 M2型，还有即表达 CD86也表达ARG1的M1/M2混合型，提示在肿瘤组织中的巨噬细胞的表型呈现多样性和复杂性。 8、肿瘤外泌体富含MIF。MIF的小分子抑制剂能显著抑制肿瘤外泌体诱导的M1型巨噬细胞中Arg-1的表达上调。 结论： 肿瘤细胞产生的细胞因子和外泌体均能改变肿瘤相关巨噬细胞的表型，但二者在巨噬细胞极化过程中发挥不同的作用。肿瘤外泌体能使未极化的巨噬细胞（M0型）呈现M1/M2混合表型；使M1型巨噬细胞表现为M2a型，但和经典的M2a型细胞不同；使M2a型巨噬细胞表现为M1型，而使M2c型巨噬细胞表现为M1/M2混合型。在小鼠原位乳腺癌组织中的巨噬细胞既有M1型、也有M2型，还有M1/M2混合型。因此，肿瘤相关巨噬细胞呈现复杂的表型。肿瘤外泌体富含 MIF，而MIF的小分子抑制剂能逆转肿瘤外泌体诱导的 M1型巨噬细胞内Arg1上调。因此，MIF的小分子抑制剂有可能成为新型抗肿瘤药物，有必要进行深入的研究。

目录

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中英文缩略词表

第1章 引言

1.1肿瘤的研究现状

1.2 肿瘤微环境与肿瘤的生长和转移的关系

1.3 肿瘤相关巨噬细胞

1.4 外泌体与巨噬细胞

1.5 巨噬细胞移动抑制因子（MIF）与肿瘤

第2章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 主要药品和试剂

2.1.2 主要的仪器设备

2.1.3 主要试剂的配制

2.2 实验方法

2.2.1 细胞复苏

2.2.2 细胞传代

2.2.3 细胞冻存

2.2.4 骨髓来源原代巨噬细胞的培养

2.2.5 外泌体的提取及鉴定

2.2.6 细胞总RNA的提取(6孔板)及反转录

2.2.7 荧光定量PCR

2.2.8 外泌体的标记及染色

2.2.9 免疫荧光

2.2.10 T细胞功能实验

2.2.11基因组学（microarray）

2.2.12 流式细胞术

2.2.13 蛋白质定量

2.2.14 Western blot

2.2.15 统计学分析

第3章 结果

3.1 细胞外泌体与细胞因子对巨噬细胞表型的不同影响

3.2 4T1细胞外泌体与巨噬细胞共培养后基因的变化

3.2.1 4T1细胞来源外泌体的纯化与鉴定

3.2.2 4T1细胞外泌体与M0型巨噬细胞共培养后基因表达的变化

3.2.3 4T1细胞外泌体与M1型巨噬细胞共培养后基因表达的变化

3.2.4 4T1细胞外泌体与M2a型巨噬细胞共培养后基因表达的变化

3.2.5 4T1细胞外泌体与M2c型巨噬细胞共培养后基因表达的变化

3.2.6 基因测序结果的验证

3.3 4T1诱导的小鼠原位乳腺癌肿瘤组织中巨噬细胞的表型

3.4 MIF抑制剂IMG122对外泌体重构巨噬细胞的影响

第4章 讨论

第5章 结论

致谢

参考文献

综述：外泌体对肿瘤微环境作用的研究进展