牛乳中链霉素残留检测ELISA试剂盒的研制

摘要

氨基糖苷类抗生素是一类应用广泛的广谱抗菌药物，主要包括链霉素(SM)、庆大霉素(GM)、卡那霉素(KM)等，对奶牛乳房炎、子宫内膜炎等有很好的疗效，常用作兽医临床治疗及饲料药物添加剂。然而不规范用药会引起畜禽产品尤其是泌乳动物乳汁中的药物残留，对人类的健康构成潜在危害。 国内外已经建立了多种检测牛奶中链霉素贱留的理化检测方法，虽然有些方法比较灵敏、精确，但由于方法复杂、耗时长、花费大、技术要求高等原因而不适合大批量样品的筛选。作为一种灵敏、快速、特异性强的方法，酶联免疫吸附测定法正逐渐应用于药物的残留检测。 为探索一种能够快速有效的检测牛奶中链霉素残留的方法，本研究采用单克隆抗体技术和酶联免疫吸附测定等技术，合成人工抗原，制备出抗链霉素单克隆抗体，建立了检测牛奶中SM残留的ELISA测定法，组建成链霉素快速检测试剂盒并进行了优化和实际应用。 分别采用CMO法、活化酯法、戊二醛法合成了链霉素的5种人工抗原，从免疫原性及稳定性等方面对5种抗原进行比较，最终选择活化酯法合成的BSA-SM/b作为免疫抗原，通过杂交瘤技术获得1株能稳定分泌抗链霉素特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株5C10。制备的腹水效价为1∶1280000，蛋白浓度为26.2mg/ml，与其他抗菌药物的交叉反应率均低于0.1％。 利用5C10杂交瘤细胞株的小鼠腹水单抗建立了检测SM残留的间接竞争ELISA方法。采用包被抗原稀释度1∶3200，腹水抗体的工作浓度1∶1.6×105，标准曲线线性方程为y=1.0522-0.3276x(10～1000ng/ml)，半数抑制浓度为93.22ng/ml，检测限约为5ng/ml。标准曲线的批内变异系数为11.87％，平均批间变异系数为8.017％。 初步组装试剂盒并对试剂盒的各组分的稳定性进行了检测和优化，成功建立了能在6个月内维持稳定的试剂盒，并以所组建的试剂盒对牛奶样品中的添加药物进行了测定。通过实验比较了5种样品处理方法，选择用Careez法处理并4倍稀释后用于测定。建立ELISA标准曲线的线性方程为y=1.8061-0.4932x(线性范围25～2500ng/ml)，其LOD为8.11ng/ml，低于规定的牛奶中链霉素最低残留限量200ng/ml。 对患乳房炎奶牛进行链霉素肌肉注射和乳房给药治疗，采用本试剂盒测定牛奶中的链霉素残留浓度，证实用药后牛奶的废弃期分别为至少2d和4.5d。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

前言

第一部分链霉素人工抗原的制备

第二部分链霉素单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

第三部分ELISA链霉素检测试剂盒的组装和优化

第四部分ELISA试剂盒的初步应用

结论

参考文献

致谢