猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达及其在PCV2抗体检测ELISA方法建立和单克隆抗体制备中的应用

摘要

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)近年来被认为是断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的致病因子。PMWS主要引起断奶保育猪进行性消瘦。自1991年在加拿大健康断奶仔猪群中首次发现PMWS以来，世界上许多养猪国家和地区都报道了该病的发生和流行。本病主要临床症状为消瘦、呼吸困难、淋巴结肿大、腹泻、苍白及黄疸。 诊断PCV2最常用的血清学方法包括间接免疫荧光试验(IFA)和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)。间接免疫荧光试验与免疫过氧化物酶单层试验需要专业的实验技术人员且繁琐耗时。酶联免疫吸附试验克服了间接免疫荧光试验与免疫过氧化物酶单层试验中人为因素造成的偏差，体现出其独特的优越性。最近用酶联免疫吸附试验检测PCV2感染多见报道，其中用PCV2单克隆抗体建立的间接竞争EL．ISA表现出较高的敏感性和特异性。 本研究根据猪圆环病毒2型(PCV2)南农株的全基因组序列(DQ104422)，设计一对引物，利用PCR技术，从PCV2毒株中扩增出不含核定位序列的ORF2基因，并克隆入pGEM-T easy载体中，根据蓝白斑筛选及限制酶酶切分析得重组质粒pGEM-ORF2。经序列测定验证正确后，将目的基因克隆入原核表达载体pGEX-6P-1的谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因的下游，获得重组质粒pG：EX-ORF2。把重组质粒转化大肠杆菌BL21，在37℃、IPTG诱导下进行表达。通过对重组大肠杆菌的菌体裂解物的SDS．PAGE电泳分析及Western-blot鉴定，表明重组菌能正确表达GST-Cap融合蛋白。 利用原核表达的猪圆环病毒2型重组融合蛋白作为抗原，建立了检测猪圆环病毒2型抗体的间接ELISA方法。对ELISA的反应条件进行了优化，最终选择重组蛋白抗原的最适包被浓度为3gg/ml，最适包被条件为常温(约25℃)1h加4℃过夜，待检血清稀释度为1：200。包被的重组蛋白不与猪瘟(HCV)、猪伪狂犬病(PRV)、猪细小病毒病(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的阳性血清发生交叉反应，建立的ELISA方法有良好的特异性。间接ELISA方法的建立为试剂盒的研制与开发奠定了基础。 以纯化的融合蛋白(GST-Cap)作为免疫原，通过腹部皮下注射免疫BALB/c小鼠，末次加强免疫后3d无菌取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，进行HAT选择培养，经间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选获得了2株分泌抗PCV2 Cap蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别命名为1D2和6D8，其细胞培养上清效价分别为1：256、1：1024，小鼠腹水效价分别为1：8192、1：131072。ELISA结果显示，1D2和6D8仅与表达的Cap蛋白反应，而与空载体pGEX-6P-1表达的蛋白、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒不反应。间接免疫荧光结果显示，6D8能与PCV2发生荧光反应，而不与PCVl发生交叉反应，表明所获得的6D8是PCV2型特异性的。1D2与PCV2、PCV1均不发生荧光反应。Western-blot分析结果显示1D2和6D8均能与PCV2Cap蛋白发生反应。这2株单抗的获得为进一步研究PCV2-ORf2基因的功能及建立准确快速的PCV2的诊断方法提供了工具。

目录

论文说明：符号说明

摘要

前言

论文研究一猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆及原核表达

材料与方法

结果

讨论

论文研究二猪圆环病毒2型ELISA检测方法的建立

材料与方法

结果

讨论

论文研究三抗猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

材料与方法

结果

讨论

全文小结

参考文献

附录

致谢