猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达及表达产物在ELISA建立和单克隆抗体制备中的应用

摘要

猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2，PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的病原，它不但可以引起断奶仔猪发生衰竭、死亡，还与多种疾病的发生密切相关。这些疾病的广泛流行严重影响养猪业，给好多国家和地区带来巨大的损失。PCV2的感染可以造成免疫抑制，引起其他各种病原的继发感染，造成的间接损失难以估计。PCV2已经成为严重阻碍养猪业发展的主要病原之一。目前，还没有一种可靠的、适于大规模诊断和检测PCV2的方法，其原因在于PCV1在猪群中的感染比较普遍，且与PCV2的核苷酸同源性较高，存在抗原交叉现象，现有的检测方法或者难以将其区分，或者不适合大规模的临床样本检测与开展流行病学调查。PCV2特异性的抗原位点主要集中在ORF2区域。ELISA方法适用于大规模的临床样本检测，若用PCV2 ORF2的表达产物建立ELISA检测方法就能够达到既区分PCV1和PCV2又能够进行规模化检测的目的。而对于疾病的防制最根本是要建立抗原检测方法，用抗PCV2 ORF2蛋白的单抗建立检测PCV2抗原的方法可以尽早检出圆环病毒，从而可尽早防治。 本实验就是通过分子生物学手段将PCV2 ORF2进行了体外表达，并对表达的蛋白进行了纯化复性。以纯化复性蛋白为免疫原分别进行了多克隆抗体及单克隆抗体的制备工作。以期为综合防制该病提供新的实验依据。 本论文的实验由三部分构成，一是克隆出PCV2的ORF2基因，利用大肠杆菌原核表达系统，通过基因重组技术表达出ORF2基因，二是利用表达蛋白建立间接ELISA检测方法，三是用表达的蛋白免疫新西兰大白兔和Balb/c小鼠，制备抗PCV2 ORF2蛋白的多克隆抗体和单克隆抗体，用所建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选，以期获得高效稳定分泌抗PCV2 ORF2蛋白抗体的杂交瘤细胞株。主要结果如下： 1．参照已发表的PCV2基因组序列，设计引物，扩增PCV2 ORF2基因的后部约580bp片断。与载体pET-32a Vector连接，转化BL21-△E3细胞后挑取阳性克隆，经酶切鉴定和测序验证后用IPTG进行诱导，SDS-PAGE分析，表明ORF2基因均在大肠杆菌中得到了表达。其表达量约为菌体蛋白的30％。Western blot表明PCV2 ORF2表达产物分子量约为28ku。 2．将表达的PCV2 ORF2蛋白纯化并复性，纯化蛋白经SDS-PAGE检测未见其他杂带。纯化后的蛋白按照墨克蛋白复性试剂盒说明书进行了复性。经Western blot检测表明，复性后的重组蛋白能被PCV2多克隆阳性血清所识别。具有良好的反应原性。 3．纯化复性的PCV2 ORF2蛋白作为包板抗原建立间接ELISA检测方法。通过对抗原包被浓度、抗体稀释度、二抗浓度、各步骤作用时间等的摸索，得出了重组抗原最适包被浓度为0.5mg/L，最适包被条件为4℃过夜，血清稀释度为1：160，酶标二抗工作浓度为1：7500，待检血清和酶标二抗的反应时间均为37℃45min，底物37℃显色10min。阻断试验表明建立的间接ELISA对PCV2抗体具有很好的特异性。板内和板间重复性试验结果为，同1份血清板内各孔的变异系数均值为2.78％，板间同一份血清OD值变化也不大。表明本方法的重复性好。 4．用复性的PCV2 ORF2蛋白免疫了家兔和Balb/c小鼠，制各了高效价的多克隆抗体。ELISA方法检测兔和小鼠抗PCV2 ORF2蛋白多克隆抗体的效价分别达到了1：12800及1：10<'7>。用复性的PCV2 ORF2蛋白作为免疫原制备单克隆抗体，获得了分泌抗PCV2ORF2蛋白抗体的杂交瘤细胞，选取阳性孔OD值较高的两孔(OD值分别为0.734，0.781)进行了扩大培养并冻存。

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第一章猪圆环病毒研究进展

1.1猪圆环病毒概述

1.1.1猪圆环病毒的发现和命名

1.1.2猪圆环病毒的病毒学分类地位

1.1.3猪圆环病毒全球的流行和分布状况

1.1.4猪圆环病毒的特性

1.1.5猪圆环病毒的基因组

1.1.6猪圆环病毒的复制与转录

1.1.7猪圆环病毒编码蛋白的研究

1.1.8组织病理学研究

1.1.9 PCV2相关疾病

1.2猪2型圆环病毒致病机理的研究进展

1.2.1猪圆环病毒免疫应答情况研究进展

1.2.2猪2型圆环病毒致病机理的研究进展

1.3猪圆环病毒检测方法的研究进展

1.3.1病毒分离

1.3.2间接免疫荧光试验(Immol/Lune fluorescence assay,IIF)

1.3.3聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)

1.3.4酶联免疫吸附试验(ELISA)

1.3.5原位核酸杂交试验(ISH)

1.4 PCV2单克隆抗体的研究进展

1.5猪圆环病毒感染的防制

1.6论文设计思路及技术路线

第二章猪2型圆环病毒ORF2基因的原核表达

2.1材料与方法

2.1.1菌种和质粒

2.1.2主要仪器

2.1.3主要药品及试剂

2.2方法

2.2.1目的片段的扩增、纯化与回收

2.2.2目的基因的克隆

2.2.3重组质粒的提取与鉴定

2.2.4重组ORF2基因原核表达载体的构建

2.2.5重组融合蛋白PET-32a-ORF2的诱导表达及检测

2.2.6 PET-32a-ORF2表达蛋白的纯化与复性

2.3结果

2.3.1 PCR扩增ORF2基因电泳结果

2.3.2 pMD18-T-ORF2重组质粒的酶切鉴定

2.3.3重组质粒pET-32a-ORF2的酶切鉴定

2.3.4重组质粒pET-32a-ORF2在宿主菌中的诱导表达

2.3.5 pET-32a-ORF2表达产物western blot鉴定

2.3.6 pET-32a-ORF2表达产物的纯化

2.4讨论

2.4.1表达区域的选择

2.4.2 PCV2 ORF2的纯化及复性

2.5 小结

第三章猪圆环病毒间接ELISA检测方法的建立

3.1材料

3.1.1主要仪器设备

3.1.2 ELISA检测部分相关试剂的配制

3.2方法

3.2.1抗原包被浓度及抗体稀释度的确定

3.2.2抗原包被条件的确定

3.2.3封闭液的确定

3.2.4酶标二抗稀释度的确定

3.2.5血清最佳作用时间的确定

3.2.6酶标二抗最佳作用时间的确定

3.2.7显色时间的确定

3.2.8重复性检验

3.2.9阻断试验

3.2.10符合率检验

3.3结果与分析

3.3.1抗原最适包被浓度和抗体最佳稀释度的确定

3.3.2酶标二抗工作浓度的确定

3.3.3血清及酶标二抗最佳反应时间的确定

3.3.4封闭液的确定

3.3.5包被条件的确定

3.3.6显色时间的确定

3.3.7重复性试验

3.3.8阻断试验结果

3.3.9符合率检验结果

3.4讨论

3.4.1 ELISA工作条件的确定

3.4.2 ELISA方法的符合性、稳定性及特异性

3.5 小结

第四章CAP蛋白多克隆抗体及单克隆抗体的制备

4.1材料

4.1.1试验动物

4.1.2主要试剂及材料

4.1.3主要器材

4.2方法

4.2.1多克隆抗体的制备

4.2.2单克隆抗体的制备

4.3结果与分析

4.3.1 PCV2 ORF2多克隆抗体效价测定结果

4.3.2免疫小鼠的抗体测定结果

4.3.3细胞融合及阳性杂交瘤细胞的筛选

4.4讨论

4.4.1动物免疫与抗血清的制备

4.4.2抗体的检测

4.5小结

结论

参考文献

致谢

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