产单核细胞李斯特菌iap基因的克隆、表达及致病性李斯特菌的快速检测

摘要

本文的研究目的是：(1)以iap基因为基础，用大肠杆菌表达系统高效表达其融合蛋白；(2)建立PCR体系，用于高效、快速、可靠地检测李斯特菌属以及区分其中的两个致病种-产单核细胞李斯特菌和伊氏李斯特菌；(3)对扬州地区市场食品中致病性李斯特菌的污染率进行初步的调查研究。 1．产单核细胞李斯特iap基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 本研究对产单核细胞李斯特菌iap基因进行PCR扩增，将其重组到原核表达载体pET30a(+)和pGEX 6p-1中，重组质粒分别命名为pET 30a(+)-iap和pGEX 6p-1-iap。然后将这两种重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和 BL21。获得的重组菌BL21(DE3)(pET30a(+)-iap)和BL21(pGEX6p-1-iap)经IPTG诱导及表达条件的优化后，SDS-PAGE结果表明，iap基因成功的获得了表达。其表达产物经超声波裂解，高速离心分离上清和沉淀，分别进行SDS-PAGE分析，结果显示BL21(DE3)(pET30a(+)-iap)和BL21(pGEX6p-1-iap)的表达产物p60蛋白为部分可溶性蛋白。过柱纯化之后的产物浓度分别为2.6mg/ml和1.8mg/ml。得到带有两种不同标签的可溶性的iap基因产物p60重组蛋白，为进一步研究p60蛋白提供了材料。 2.致病性李斯特菌PCR快速检测方法的建立 致病性李斯特菌在环境中广泛存在，且存在共生现象，并且两种致病性李斯特菌的危害对象并不相同。建立快速而有效的方法鉴定致病性李斯特菌以及区分产单核细胞李斯特菌和伊氏李斯特菌在科学研究与疾病控制方面都非常有必要。本研究利用李斯特菌属特异性毒力因子iap、溶血性李斯特菌特异性毒力因子hly和产单核细胞李斯特菌特异性毒力因子inlB，建立了基于聚合酶链式反应的检测体系，用于高效、快速、可靠地检测李斯特菌以及区分其中的两个致病种即产单核李斯特菌和伊氏李斯特菌。PCR体系可检测到3.46pg伊氏李斯特菌DNA和3.93pg产单核细胞李斯特菌DNA。对16小时LEB增菌培养的模拟污染生猪肉、水和牛奶的增菌培养液用PCR检测，结果检测限达10CFU/10克生猪肉、10CFU/10ml水或牛奶。 3.食品和环境中致病性李斯特菌污染率调查研究 为了解扬州地区致病性李斯特菌即产单核细胞李斯特菌和伊氏李斯特菌在各类食品及市场环境样品中的污染情况。自2007年2月.2007年4月采集扬州地区三个农贸市场(A、B、C)的各类食物样品630份，市场环境污水样品190份，采用增菌培养、选择性培养和PCR.鉴定方法对上述820份样品进行致病性李斯特菌的分离鉴定。结果显示，农贸市场A、B、C的各类食物样品和市场环境污水Lm的平均污染率为1.34％，其中污染率最高的是市场B的猪肉样品，达3.75％，污染率最低的为市场A的污水和海产品以及市场B和C的蔬菜样品，污染率均为0％。统计学结果显示各市场生肉样品Lm的平均污染率(2.92％)要显著高于其它食品中的污染率。三个农贸市场820份样品中，市场B和市场C的海产品淡菜中各检出1份伊氏李斯特菌阳性样品，阳性率为0.24％，其中污染最严重的是市场B的海产品，污染率达1.43％，其余样品污染率均为0％。此外，两份伊氏李斯特菌阳性样品均存在两种致病性李斯特菌混合污染，其余样品中未检测到混合污染。从上述结果可以看出：(1)扬州地区各类食物样品以及市场环境污水存在不同程度的致病性李斯特菌污染；(2)新鲜猪肉比其它食品更适合Lm的生长或传播；(3)伊氏李斯特菌在海产品中偶见污染，值得注意。以上结果为食品安全措施的制定提供了科学的依据。

目录

论文说明：符号说明

综述 产单核细胞李斯特菌的毒力因子和毒力岛

一、概述

二、产单核细胞李斯特菌毒力因子与毒力岛

三、展望

参考文献

第一章产单核细胞李斯特菌iap基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

1材料与方法

2结果

3讨论

第二章致病性李斯特菌双重PCR快速检测方法的建立

1材料与方法

2结果

3讨论

第三章食品和环境中致病性李斯特菌污染率调查研究

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

致谢