黑色素瘤小鼠高转移模型体内筛选和细胞系的建立

摘要

目的：采用深度免疫缺陷动物，并通过手术切除肿瘤进行高转移模型体内综合筛选的实验思路，建立鼠源和人源黑色素瘤小鼠高转移模型及相应细胞系，同时观察相关生物学特性，探讨转移相关机理，为肿瘤的预防、诊断和治疗等提供理想的动物模型。 方法：1.小鼠黑色素瘤高转移模型的体内筛选和细胞系的建立： 将小鼠黑色素瘤B16移植于T、B、NK细胞联合免疫缺陷的BNX小鼠皮下，首先进行皮下移植→手术切除→肺转移→皮下移植的连续三代体内筛选，再按照皮下移植→肺转移→皮下移植的方法继续进行三代筛选，建立移植性自发高转移模型，同时进行肿瘤的生长、转移情况和病理组织学的观察。采用组织块法对小鼠黑色素瘤高转移肿瘤组织进行原代培养及建立细胞系，观察肿瘤细胞的形态学、生长速度、体外侵袭能力、染色体形态分析、细胞周期变化、体内验证皮下移植的成瘤率和转移情况。 2.人黑色素瘤高转移模型的体内筛选及微转移动态检测： 利用人黑色素瘤A357细胞株进行SCID小鼠皮下移植实验时，发现6只动物中有1只发生明显肺转移，取肺转移灶移植至SCID小鼠皮下扩增。采用皮下移植→肺转移→皮下移植体内反复筛选的方法，建立皮下移植小鼠肺高转移动物模型(血路转移合并淋巴道转移)及相应的人黑色素瘤高转移细胞系，并进行相关生物学特性的初步研究。同时应用该细胞系建立BNX小鼠皮下移植瘤模型，通过Alu-PCR进行动态、定性的肺微转移检测。 结果：1.小鼠黑色素瘤高转移模型的体内筛选和细胞系的建立： 通过体内综合筛选，成功建立了BNX小鼠B16黑色素瘤皮下移植肿高转移模型。该模型的皮下移植成瘤率可达100％，35d时肺转移率达到91.7％(1l/12)，转移程度达到+++。同时建成相应的高转移细胞系，将其命名为B16-sci，其倍增时间为46.07h，自然凋亡率显著低于B16细胞(19<0.05)，体外侵袭能力显著强于B16细胞(P<0.05)，染色体分析结果表明B16-sci细胞符合小鼠恶性肿瘤细胞染色体的特点。体内验证结果表明，B16-sci细胞移植于BNX小鼠皮下，已能稳定形成100％(6/6)肺转移，同时提高了该细胞在C57BL/6J小鼠皮下移植后的肺转移率。 2.人黑色素瘤SCI-375高转移模型的筛选及微转移动态检测： 经体内反复筛选，成功建立了皮下移植小鼠肺转移动物模型(血路转移合并淋巴道转移)。潜伏期从筛选初期的7-14天逐渐缩短至5天左右，荷瘤寿命从60—75天下降并稳定在45天左右。筛选传代的243只SCID小鼠，皮下100％成瘤，肺转移率随着筛选的进行，逐代提高，第6代起肿转移率保持在100％。建成了相应的高转移细胞系，并将其命名为SCI-375，其倍增时间为21.60h，体外侵袭能力强于未筛选的A375(P<0.05)，染色体分析结果显示该细胞具有人类恶性肿瘤细胞染色体的特点。体内验证结果表明：SCI-375在不同免疫缺陷动物体内均能表达较高的转移率，BNX小鼠肺转移率为100％(13/13)，裸小鼠肺转移率为90.91％(10/11)。Alu-PCR结果显示：2W时，PCR检测和常规病理检测肺转移均为阴性；3w、4W、5w时，PCR检测肺转移率分别为(37.5％)3/8、(75％)6/8、(100％)10/10，常规病理检测肺转移率分别为(0％)0/8、(37.5％)3/8、(50％)5/10。可见，分子生物学的方法可以早期检测肿瘤微转移情况的发生，其灵敏度和高效性要优于常规病理检测。 结论：1.利用深度免疫缺陷动物以及手术切除肿瘤进行高转移模型的体内筛选的实验思路，成功建立了一个肺转移率高、转移特性稳定、直观性好、操作简便的B16黑色素瘤皮下移植小鼠自发高转移模型及相应的细胞系。 2.成功建立了人黑色素瘤皮下移植小鼠自发高转移模型及相应的细胞系，而且存在血路和淋巴两个转移途径；在不同免疫缺陷小鼠体内表达和应用并获得证实。用PCR技术的高敏感性，通过扩增特异的基因片段，对其在小鼠体内的微转移进行动态检测。 3.为探讨肿瘤转移的生物学机制和抗转移治疗提供了理想的动物模型及相应的细胞系。

目录

论文说明：符号说明

声明

摘要

前言:肿瘤模型及黑色素瘤模型研究进展

第一章小鼠黑色素瘤高转移模型体内筛选和细胞系的建立

一、B16黑色素瘤在不同小鼠体内转移潜能的比较

1.1材料

1.2方法

1.3实验结果

二、B16黑色素瘤皮下移植高转移模型的体内筛选

2.1材料

2.2方法

2.3结果

三、B16黑色素瘤高转移细胞系的建立和生物学特性的初步研究

3.1材料

3.2方法

3.3结果

四讨论

第二章人黑色素瘤SCI-375高转移模型的筛选及微转移动态检测

一、人黑色素瘤SCID小鼠皮下移植高转移模型的体内筛选

1.1材料

1.2方法

1.3结果

二、SCI-375高转移细胞系的生物学特性的研究

2.1材料

2.方法

3.3结果

三、SCI-375在BNX小鼠体内微转移的动态检测

3.1材料

3.2方法

3.3结果

四、讨论

结论与展望

一、结论

二、展望

[参考文献]

致谢

攻读学位期间发表的学术论文及所参加的科研项目