基于thyA基因的染色体-质粒平衡致死系统的构建

摘要

目前，外源基因表达载体多以抗生素抗性基因作为选择标记，对于基因治疗和基因免疫用表达载体，这些抗性标记基因的存在有可能引起一系列生物安全性问题。因此，需用更为安全的非抗生素抗性标记表达载体，其中染色体．质粒平衡致死系统具有广泛的应用前景。 为了构建用于动物基因治疗和基因免疫的非抗性标记表达载体，我们将DH5a大肠杆菌在含有胸腺嘧啶核苷和3-甲氧2-氨嘧啶的CBT培养基上进行选择培养，筛选得ThyA-突变株21株。这些突变株在不含胸腺嘧啶核苷的CB琼脂平板上不生长，只有在添加胸腺嘧啶核苷的培养基或转化thyA表达载体后才能在正常培养基生长。为了研究thyA基因突变的分子机理，用高保真PCR法克隆4个突变株的thyA基因，序列分析结果显示，4、7、13号菌株在70位碱基起有6个碱基缺失，导致25位甘氨酸和26位苏氨酸的缺失；6号突变株在92位碱基由G突变为A，导致31位甘氨酸被天冬氨酸替换。用PCR克隆野生大肠杆菌的ThyA基因，将其克隆入原核表达载体，用重组大肠杆菌表达的重组蛋白免疫小鼠，用获得的抗血清进行免疫转印试验，结果发现突变株的ThyA基因仍能表达。 根据鼠伤寒沙门氏菌菌株thyA基因序列设计一对引物，用PCR扩增包括启动子的thyA基因，将序列正确的基因取代表达人溶菌酶基因的真核载体pcDNAKYZ中的卡那抗性基因，获得非抗性选择标记表达载体pDTALYZ。将其转化ThyADH5a大肠杆菌，转化菌涂布不含胸腺嘧啶核苷的CB平板，筛选得非抗性标记重组大肠杆菌。在CBt液体培养基传20代未发现质粒丢失，酶切鉴定正确。将pcDNAKLYZ重组菌和pDTALYZ重组菌在相同条件下，以普通的LB为培养液进行高密度发酵培养，发现两种重组菌的生长曲线无明显差异；发酵结束后，定量取样提取质粒DNA和进行定量测定，结果显示两种重组菌的质粒产量无差异；定量取样分别在普通和选择培养基上培养，发现两种重组菌的质粒丢失率分别为38.1％和15.7％。

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摘要

文献综述染色体-质粒平衡致死系统的构建与应用

1.基因治疗与基因免疫

1.1基因治疗

1.2基因免疫

2.重组载体的设计要求

2.1与宿主基因组整合及诱发突变的危险性

2.2诱发自身免疫或免疫耐受的危险性

2.3水平传播及对环境的危害性

2.4在动物产品中的残留及其对人体的危害性

3.染色体—质粒平衡致死系统

3.1基本原理

3.2常用的营养缺陷标志基因

3.3染色体—质粒平衡致死系统的构建

3.4染色体—质粒平衡死系统的应用

4.问题与展望

参考文献

研究内容一：ThyA-大肠杆菌突变株的筛选与鉴定

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1 ThyA-大肠杆菌的选育

2.2突变株生长特性

2.3突变株的稳定性

2.4突变基因的序列分析

表达大肠杆菌ThyA-基因载体的构建

2.5重组ThyA的表达

2.6 ThyA抗体的制备与鉴定

2.7突变株ThyA基因表达分析

3讨论

参考文献

研究内容二：以thyA基因为非抗性选择标记真核表达载体的构建

1材料与方法

1.1质粒与菌株

1.2主要试剂

1.3试验动物

1.4 PCR引物的设计

1.5 DNA模板的制备

1.6 thyA基因的PCR扩增

1.7 PCR产物回收

1.8 pDTALYZ的构建

1.9重组质粒的转化

1.10发酵过程中重组菌的遗传稳定性

2结果

2.1 PCR扩增产物电泳结果

2.2 pDTALYZ的酶切鉴定

2.3 pDTALYZ与ThyA-大肠杆菌转化

2.4转化效率的比较

2.5发酵过程中的遗传稳定性

3讨论

参考文献

结论

致谢