小鼠肝炎病毒N基因的表达与间接ELISA检测方法的建立和应用

摘要

小鼠肝炎病毒(Mouse Hepatitis Virus，MHV)属于冠状病毒科冠状病毒属(Coronavirus)，是一个单股正链RNA病毒，带毒小鼠广泛存在于世界各国的实验小鼠群中。不同类型、不同毒株病毒在不同品系、年龄和免疫状态的小鼠中可引起肝炎、脑脊髓炎和肠炎等许多不同的症状。通常情况下，大多数带毒小鼠呈隐性感染，但与某些微生物发生混合感染时，或在实验条件的刺激下常会爆发疾病，是啮齿类实验动物最难清除的病毒之一。鼠群感染小鼠肝炎病毒会改变各种免疫应答参数，干扰试验结果，因此建立快速诊断方法十分必要。 目前，检测小鼠肝炎病毒的方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠肝炎病毒抗体。其包被抗原为纯化的病毒，由细胞增殖方法获得，此方法很难获得高滴度的病毒，而且病毒分离复杂繁琐。相比之下，用融合蛋白做抗原建立血清学检测方法，具有更好的特异性和敏感性，同时操作比较方便，不会因杂蛋白而产生假阳性结果。 本研究根据已发表的MHV N基因序列设计特异性引物，以逆转录的小鼠肝炎病毒cDNA为模板，用RT-PCR方法扩增出N基因主要抗原片段NP(S)，将其克隆到pGEM-T-easy载体中，鉴定正确的N(S)基因片段亚克隆入pGEX-6p-1原核表达载体中，转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达得到重组蛋白NP(S)，NP(S)经纯化后用SDS-PAGE和Western-blot对其进行验证，结果表明，表达的融合蛋白NP(S)分子量为56x103，与预期大小相符，能与MHV阳性血清发生特异性反应，说明NP(S)抗原性较高，可以作为检测小鼠肝炎病毒血清抗体的抗原。 将纯化的融合蛋白NP(S)作为包被抗原，建立了检测小鼠肝炎病毒抗体的间接ELISA方法，确定了包被抗原的浓度、血清和酶标抗体的稀释浓度以及判定标准。经特异性试验、敏感性试验、稳定性实验以及对比试验，表明本研究建立的间接ELISA特异性强，敏感性、重复性好，为进一步开发MHV血清抗体诊断试剂盒奠定了基础。

目录

论文说明：符号说明

声明

综述：小鼠肝炎病毒研究进展

第一部分小鼠肝炎病毒N基因的克隆、表达及免疫学初步研究

1材料

2方法

3结果

4讨论

第二部分小鼠肝炎病毒间接ELISA检测方法的建立及应用

1材料

2方法

3结果

4讨论

结论

参考文献

附录

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文