禽腺病毒hexon基因克隆表达及间接ELISA和荧光PCR检测方法的建立

摘要

禽腺病毒属于禽腺病毒科禽腺病毒属，根据其抗原性的不同可分为3个群，其中Ⅰ群禽腺病毒包含12个血清型。Ⅰ群禽腺病毒含有相同的群抗原，其中比较著名的病毒株有鸡胚致死孤儿病毒、鹌鹑支气管炎病毒、鸡包涵体肝炎病毒。所有年龄的家养禽均为易感，临床和病理症候群包括肝炎、再生障碍性贫血、出血、轻度呼吸道疾病和产蛋量减少。Ⅰ群禽腺病毒既可水平传播，也可垂直传播。 根据GenBank上的CELO病毒六邻体(hexon)基因序列，通过软件比较禽腺病毒hexon氨基酸序列，结合二维结构图提示的多肽暴露情况以及抗原性预测分析，设计并合成了一对特异性引物，对禽腺病毒1型CELO株的hexon主要抗原性多肽片段进行PCR扩增，与PGEX-4T-1原核表达载体连接，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，经0.2mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖诱导表达，SDS-PAGE电泳分析表明，表达的融合蛋白分子量为72.24kD，占全菌蛋白的34％。Western-blotting结果表明：原核表达的hexon重组蛋白具有抗原性，能与感染FAV的阳性血清反应。 另外，分别用不同浓度的尿素和Triton X-100对hexon重组蛋白进行包涵体纯化，蛋白的终浓度为30μg/mL。经BandScan4.3生物图象分析软件分析蛋白的纯度为85.0％。达到较高的浓度和纯度，说明本试验探索的纯化方法能有效的纯化这些重组蛋白。 其次，将纯化的hexon蛋白作为包被用抗原进行间接酶联免疫吸附试验(ELISA)，确定其最佳包被浓度为10μg/mL；一抗稀释度为1：200；HRP酶标羊抗鸡IgG稀释度为1：5000，重组蛋白不与NDV、AIV、EDSV、ARV阳性血清发生交叉反应，具有较好的特异性。本研究初步建立了能检测FAV抗体的重组蛋白ELISA诊断方法，用这种方法对FAV的12个血清型病毒免疫SPF鸡的血清进行检测，结果表明该方法在FAV抗体检测方面具有较高的敏感性。 最后，根据GenBank中Ⅰ群禽腺病毒hexon基因的保守序列设计了一对引物，建立了检测Ⅰ群禽腺病毒12个血清型的SYBR Green Ⅰ荧光PCR方法。以质粒DNA为标准品，建立了标准曲线及熔解曲线。同时进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果显示，制作的标准曲线中各浓度范围内有较好的线性关系且线性范围宽；与．AIV、IBDV等非Ⅰ群禽腺病毒不发生交叉反应，灵敏度达1×102拷贝/μL，表明具有较好的特异性和敏感性；重复性试验结果表明，具有良好的准确性。本方法从病毒核酸提取至检测完成仅需5h左右，操作简便快速，为快速、准确检测Ⅰ群禽腺病毒提供了一种有效的方法。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章文献综述

第一节禽腺病毒病概况

1禽腺病毒分类

2禽腺病毒形态结构和理化特性

3禽腺病毒基因组结构和主要蛋白

4禽腺病毒的流行病学与致病性

第二节诊断技术的研究进展

1电子显微镜法和包涵体检查

2病毒分离

3血清学检测技术

第三节实时荧光PCR方法研究概况

第二章禽腺病毒1型hexon主要抗原性基因的原核表达及纯化

1材料和方法

1.1病毒、菌种及抗体

1.2主要试剂

1.3病毒DNA的提取

1.4CELO株Hexon主要抗原性基因的PCR扩增

1.5重组表达载体的构建与鉴定

1.6 Hexon蛋白的表达及最佳诱导条件的探索

1.7纯化产物的Western-blotting鉴定

1.8 Hexon蛋白的提取及纯化

1.9蛋白质浓度、纯度的检测及保存

2结果分析

2.1 PCR扩增克隆与鉴定

2.2蛋白的诱导表达

2.3蛋白可溶性分析及Western-blotting检测

2.4重组蛋白的表达及纯化

2.5蛋白质浓度的计算

3分析及讨论

第三章Hexon主要抗原性基因蛋白ELISA检测方法的建立

1材料和方法

1.1抗原和菌种

1.2主要试剂

1.3血清的制备

1.4 hexon重组蛋白ELISA检测方法的建立

1.5阴、阳临界值的确定

1.6特异性试验

1.7人工感染SPF鸡的敏感性试验

1.8稳定性试验

1.9间接ELISA方法的应用

2结果

2.1间接ELISA诊断方法最佳工作条件的确定

2.2 ELISA程序确定

2.3间接ELISA阴、阳性临界值的确定

2.4特异性试验

2.5敏感性试验

2.6重复性试验

2.7间接ELISA方法的应用

3讨论及结论

第四章SYBR Green I荧光PCR方法检测Ⅰ群禽腺病毒

1材料与方法

1.1病毒、菌种和载体

1.2主要试剂和仪器

1.3引物设计

1.4病毒DNA提取

1.5标准品的制备

1.6核酸浓度及纯度测定：

1.7质粒DNA的10倍梯度稀释方法

1.8扩增曲线的建立

1.9标准曲线的建立

1.10敏感性试验

1.11交叉性试验

1.12重复性试验

1.13 Ⅰ群禽腺病毒的检测

2结果

2.1 hexon P1基因的扩增

2.2重组质粒的PCR鉴定

2.3质粒DNA浓度的测定

2.4标准曲线的建立

2.5敏感性和交叉试验

2.6重复性试验

2.7 I群禽腺病毒的检测

3分析与讨论

第五章结论

参考文献

附录 常用英文缩写

实验用主要溶液的配制

致谢

个人简历

研究生期间发表的专业论文