抗鸡IL-4单克隆抗体的研制及其双抗体夹心ELISA方法的初步建立

摘要

IL-4是一种多效性T细胞源细胞因子，通过作用于不同类型细胞来调节宿主防御和宿主免疫。IL-4在调节T、B细胞分化及Th2型免疫反应的发展中是必需的。此外，IL-4也是单核细胞和巨噬细胞激活的调节因子。 已有大量的文献研究了人、小鼠、大鼠、猪等哺乳动物的IL-4基因及其生物学活性。在家禽中，因缺乏禽类相关的特异性试剂而阻碍了禽类IL-4的研究，本研究旨在以通过制备鸡IL-4特异性单克隆抗体为基础，初步建立鸡IL-4双单抗夹心ELISA方法，为家禽的免疫检测、免疫细胞功能分析和免疫调节等方面的研究提供条件。 一、抗鸡IL-4单克隆抗体的制备与鉴定 应用淋巴细胞杂交瘤技术，用纯化的重组蛋白rGST-ChIL-4免疫8周龄BALB/c小鼠，腹部皮下和腹腔免疫，100μg/只。首免时，抗原与等量弗氏完全佐剂混合乳化经腹部皮下免疫；二免时抗原与等量不完全弗氏佐剂混合乳化经腹部皮下免疫；三免时用抗原通过腹腔直接免疫；间隔为两周；尾静脉加强免疫不加佐剂的抗原，100μg/只，3d后，取免疫鼠脾细胞和骨髓瘤SP2/0-Ag-14细胞进行融合。纯化的rHis-ChIL-4作为检测抗原，用间接ELISA方法筛选阳性克隆。获得9株稳定分泌ChIL-4的单克隆抗体细胞株，命名为16D8、17D7、18F7、18F12、19F1、20C9、20F2、20G3、6A8，它们的腹水效价依次为1，280，000、1，280，000、640，000、640，000、640，000、640，000、640，000、640，000、160，000、160，000，除16D8和20F2 McAb亚类为IgG2a外，其余均为IgGl。 试验表明，所得单抗只与相应的融合蛋白反应，与其它融合蛋白和对照细菌不反应，显示良好的特异性。Western-blot试验显示所得单抗均能与相应的融合蛋白发生反应，出现特异性条带。为鸡体内IL-4水平的检测，作为某些疾病的检测指标，用于疾病的预防和控制，进行细胞免疫机理及细胞因子间相互作用方面的研究提供了有用的材料。 二、鸡IL-4双单抗夹心ELISA方法的初步建立 通过对6株单抗抗体饱和度测定和相加指数测定进行初步筛选，采用20C9单抗以浓度为10μg/ml作为包被抗体，酶标抗体bio-16D8作为检测抗体建立抗体夹心ELISA方法，并摸索封闭液、稀释液、抗原最佳反应时间、酶标抗体最佳工作浓度、反应时间、HRP-streptavidin最佳工作浓度、反应时间、底物最佳反应时间等条件，对比试验最终选择含10％小牛血清的磷酸盐缓冲液作为封闭液，含4％PEG、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液作为稀释液，抗原反应时间为2h，酶标抗体最佳工作浓度为2μg/ml、最适反应时间为30min，HRP-streptavidin最佳工作浓度为1:2，000、最佳反应时间为30min，底物最佳反应时间为5min。此方法可检出的ChIL-4为0.039μg/ml。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:符号说明

声明

前言

1鸡IL-4概述

1.1鸡IL-4的分子基础

1.2鸡IL-4的产生、表达和生物学活性测定

1.3鸡IL-4的生物学特性

1.4 IL-4受体及其表达

1.5 IL-4R的信号传导

2鸡细胞因子单克隆抗体的研究

3鸡IL-4的检测

4单克隆抗体的应用

参考文献

第一章鸡IL-4单克隆抗体的制备及鉴定

1材料与方法

1.1菌株与试剂

1.2方法

2结果

2.1重组菌表达产物的SDS-PAGE分析

2.2杂交瘤细胞株的建立

2.3单抗生物学特性

3讨论

参考文献

第二章鸡IL-4双抗体夹心ELISA方法的初步建立

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1单克隆抗体的纯化

2.2单抗蛋白浓度测定

2.3抗体配对

2.4单抗的生物素标记

2.5双抗体夹心ELISA方法的建立

3讨论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表论文