猪胸膜肺炎放线杆菌感染特异性诊断方法的建立：PCR和夹心ELISA

摘要

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的一种高度接触传染的呼吸道疾病，给集约化养猪业造成严重的经济损失，该病以出血性坏死性肺炎和纤维素性胸膜炎为特征，APP有两个生物型，15个血清型。 猪传染性胸膜肺炎最急性型引致猪的急性死亡，无临床病症慢性感染猪往往是再次爆发和流行的潜在传染源，感染猪易引发其它病原的继发感染。所以APP感染的早期诊断成为防控该病的关键。 APP致病机理非常复杂，有众多毒力因子，Apx(A. pleuropneumoniae-RTX-toxins，Apx)是最重要的毒力因子。其中apxⅣ基因只在活体内表达，体外培养则不表达该毒素，apxⅣ基因存在于所有血清型中且高度保守，具有种特异性。 本研究致力于提高、完善APP感染的诊断技术，建立PCR诊断方法并开发研制夹心ELISA试剂盒。 1、建立APP生物I型的PCR诊断方法 PCR是一种快速的病原学诊断方法，本研究据已发表的apxⅣ毒素基因序列(登录号：CS056137，位置：1543~2418)设计一对特异性引物，建立检测APP1～12血清型的PCR方法。血清型1~12标准菌株和5株野毒株均能扩增出预期876bp片段，而副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、猪放线杆菌、猪霍乱沙门氏菌、奇异变形杆菌、支气管败血波氏菌、猪丹毒杆菌PCR扩增结果为阴性。可检出最低活菌数为2x102cfu/mL，最低检出DNA浓度为9pg。 2、重组蛋白rApxⅣ的表达 参照GenBank中已发表的apxⅣ序列(登录号：CS056137)设计一对特异性引物，扩增血清1型标准菌株apxⅣ基因963bp片段(位置：2518~3480)，PCR产物经Ndel、Notl酶切处理后克隆到同样处理的质粒pET-22b(+)中，酶切鉴定和序列分析后将此重组质粒转化E coli BL21(DE3)，0.1 mM IPTG诱导4h获得高效表达的重组蛋白His-ApxⅣ，SDS-PAGE、Westem blot检测证实rApxⅣ分子量为35.3KDa，以可溶状态存在，含His-Tag。融合蛋白经Novagen公司的固定化镍离子亲和层析试剂盒进一步纯化。 3、单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立 按常规方法制备单克隆抗体。以纯化的重组蛋白rApxⅣ免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，以rApxⅣ和表达宿主菌的菌体蛋白为检测抗原，进行杂交瘤细胞的筛选，三次亚克隆后挑选两株分泌稳定、为IgG的杂交瘤细胞：SB7、SC11，竞争性结合试验证明它们有不同的抗原结合表位。这两株单抗制得腹水的ELISA滴度分别为1:6.4×104，1:1.28×105，以(NH4)2SO4盐析法纯化单抗。纯化的587用标准生物素方法进行标记并测得标记效价为106。建立检测ApxⅣ毒素的双抗体夹心ELISA方法，方阵滴定法确定捕获抗体最佳工作浓度为4μg/mL，Biotin-587最佳工作浓度为0.8μg/mL，rApxⅣ最低检出量为60pg/mL。 将建立的PCR和双抗体夹心ELISA分别检测10份猪病变肺组织和血清样品，阳性6份，与细菌分离鉴定结果一致，三种鉴定方法结果相符合。表明本研究建立的PCR和双抗体央心ELISA方法都可用于APP感染的临床诊断。

目录

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声明

文献综述

前 言

研究一、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌生物Ⅰ型PCR诊断方法的建立

1材料

1.1菌株及病料

1.2主要试剂

1.3寡核苷酸引物

1.4主要仪器设备

2方法

2.1细菌的最佳培养时间

2.2细菌基因组DNA提取

2.3 PCR方法的建立

2.4琼脂糖凝胶电泳

2.5 PCR方法的特异性

2.6 PCR方法的敏感性

2.7 临床样品的检测

3结果

3.1细菌的最佳培养时间

3.2 PCR方法的特异性

3.3 PCR方法的敏感性

3.4临床样品的检测

4讨论

研究二、猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣN端重组蛋白的表达与纯化

1材料

1.1菌株及病料

1.2主要试剂

1.3寡核苷酸引物

1.4主要仪器设备

2方法

2.1 PCR模板的制备

2.2apxⅣ 963 bp片段的扩增

2.3 PCR产物的回收与纯化

2.4质粒的提取

2.5大肠杆菌感受态细胞的制备

2.6 PCR产物及质粒的酶切

2.7连接反应

2.8转化

2.9重组质粒的酶切鉴定

2.10测序

2.11诱导表达

2.12 SDS-PAGE

2.13 Western blot

2.14重组蛋白的可溶性分析

2.15重组蛋白的纯化

3结果

3.1 PCR产物及质粒的酶切

3.2重组质粒的酶切鉴定及测序

3.3重组蛋白的表达及可溶性分析

3.4 western blot鉴定

3.5重组蛋白的纯化

4讨论

研究三、猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ单克隆抗体的制备及初步应用

1材料

1.1动物、病料、和细胞

1.2培养基及主要试剂

1.3主要仪器及设备

2方法

2.1抗原的制备

2.2动物免疫

2.3 rApxⅣ-ELISA方法操作程序

2.4 rApxⅣ-ELISA最佳抗原包被量和血清稀释度的选择

2.5骨髓瘤细胞SP2/0的制备

2.6饲养细胞的制备

2.7脾淋巴细胞的准备

2.8细胞融合

2.9杂交瘤的筛选

2.10杂交瘤的克隆化(有限稀释法)及建株

2.11单克隆抗体的生产和效价测定

2.12单抗稳定性的检测

2.13单克隆抗体类鉴定

2.14单克隆抗体抗原表位的鉴定

2.15单克隆抗体纯化

2.16 mAb的生物素标记及效价的测定

2.17双抗体夹心ELISA方法的建立

2.18双抗体夹心ELISA方法临界值的确定

2.19双抗体夹心ELISA方法临床应用

3结果

3.1抗原的制备

3.2 rApxⅣ-ELISA最佳抗原包被量和血清稀释度确定

3.3细胞融合

3.4杂交瘤的筛选及稳定性检测

3.5单克隆抗体的生产和效价的测定

3.6单克隆抗体类的鉴定

3.7单克隆抗体抗原表位的鉴定

3.8单克隆抗体的纯化

3.9 IgG的biotin标记

3.10 双抗体夹心ELISA方法的建立

3.11双抗体夹心ELISA方法临界值的确定

3.12双抗体夹心ELISA方法临床应用

4讨论

全文总结

参考文献

致 谢