多年生黑麦草再生体系的建立及农杆菌介导的小鼠金属硫蛋白(MT)基因遗传转化体系的研究

摘要

多年生黑麦草(perennial ryegrass)是重要的冷季型禾本科牧草和草坪草，广泛分布于温带地区，其叶片光滑柔软、色泽美丽并且绿色期长，分蘖能力强，成坪速度快，是一种优良的草坪草。哺乳动物的金属硫蛋白(Metallothionein，简称MT)是一类低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白，在动物体内主要参与必需金属离子的代谢和有毒重金属的解毒等过程。小鼠MT-I具有α和β两个结构域，这两个结构域在结构和功能上既相互联系又各有分工，并且对重金属具有不同的亲和力，其中α结构域优先结合Cd2+、Hg2+等，而β结构域优先结合Cu2+、Zn2+等。
　　 本研究以草坪型多年生黑麦草品种“马蒂达”为材料，进行了多年生黑麦草的再生体系的研究。并在此基础上，采用农杆菌介导法，开展了小鼠金属硫蛋白基因(MT)及其突变体αα基因的遗传转化初步研究，以为今后最终获得利用MT及其突变体结合并解毒重金属特性的、对Cd等重金属抗性和积累能力大大提高的新型植物，用于环境重金属污染的生态修复。研究内容与结果如下：
　　 1、多年生黑麦草的再生体系建立。以成熟种子为外植体，在附加8mg/L2，4-D和0.025 mg/L6-BA的MS培养基中诱导率最高，达56.42％。愈伤组织经过2～3次继代后分化，分化培养附加2mg/L6-BA时分化率最高，达32.25％，且愈伤组织继代后的状态明显影响分化率。在大量元素减半的MS培养基中附加0.5mg/LNAA进行生根培养，生根率达98％。
　　 2、进行了多年生黑麦草体胚发生组织学研究。采用石蜡切片研究组织培养中多年生黑麦草体细胞胚发生和发育的形态和结构特征，以了解体细胞再生形成胚胎结构的细胞分化和形态发生特征。结果表明：2，4-D诱导的多年生黑麦草体细胞胚的发生发育经历了类似合子胚的各阶段；在体细胞胚迅速发育过程中，不同阶段的体细胞胚始终与周围细胞存在明显界限；体细胞胚大部分以间接途径产生，由表层愈伤组织分化而来；为单细胞起源，能使遗传转化的再生植株避免嵌合体的产生，且长期培养也能保持良好的再生率。
　　 3、PPT和潮霉素筛选压的确定。分别以除草剂抗性基因(bar基因)相应筛选剂PPT(Basta)和潮霉素磷酸转移酶基因(hpt基因)相应筛选剂潮霉素(Hyg)对多年生黑麦草愈伤组织进行筛选研究，确定了不同筛选剂对多年生黑麦草的筛选浓度。结果表明，1mg/L PPT和30mg/L潮霉素作为黑麦草遗传转化的筛选浓度比较合适。
　　 4、运用GUS瞬时检测对农杆菌遗传转化体系进行探索。性状良好的胚性愈伤组织预培养3d，抽真空5～10min后在农杆菌菌液OD600≈0.3-0.5时浸染15min，共培养3d，附加100μmol/L的乙酰丁香酮(AS)。愈伤组织脱菌干燥后转至继代筛选培养基上，每15d筛选一次，直接进行GUS组织化学染色分析，GUS阳性率为51.61％。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一章前言

第一节多年生黑麦草简介

1黑麦草生物学特征

2黑麦草栽培技术

3黑麦草病虫害防治

第二节植物修复方法研究进展

1植物修复的定义和分类

2植物修复技术的特点

3自然界中超富集植物在植物修复中的应用

4转基因技术在植物修复中的应用

5金属硫蛋白(Metallothionein，MT)

第三节多年生黑麦草遗传转化技术研究进展

1多年生黑麦草的遗传转化方法

第四节研究的方法与目的

第二章 多年生黑麦草再生体系的建立及体细胞胚发生的研究

1材料与方法

1.1试验材料

1.2主要仪器

1.3方法

2结果与分析

2.1 2，4-D浓度对愈伤组织诱导和再生的影响

2.2 6-BA浓度对愈伤组织诱导的影响

2.3愈伤组织的继代

2.4 6-BA浓度对愈伤组织分化的影响

2.5生根和移栽

2.6体胚发生的组织细胞学观察

3讨论

3.1激素对多年生黑麦草出愈率的影响

3.2其他因素对多年生黑麦草出愈率的影响

3.3各种因素对分化的影响

3.4多年生黑麦草体细胞胚发生

第三章 多年生黑麦草遗传转化体系的研究

1实验材料和方法

1.1实验材料

1.2方法

2结果与分析

2.1潮霉素筛选压的确定

2.2 PPT筛选压的确定

2.3 GUS瞬时表达检测和筛选

3讨论

3.1 PPT和潮霉素在农杆菌转化中的作用

3.2 GUS瞬时表达检测

3.3多年生黑麦草农杆菌转化体系转化效率的影响因素

3.4 分化筛选不出芽的原因

第四章结论和后继工作

1主要结论

1.1建立了多年生黑麦草的再生体系

1.2多年生黑麦草体胚发生组织学研究

1.3 PPT和潮霉素筛选压的确定

1.4运用GUS瞬时检测对农杆菌遗传转化体系进行探索

2后继工作

参考文献

附录：MS培养基母液配制

致谢

攻读硕士学位期间发表文章