多年生黑麦草离体再生体系及农杆菌介导的高效遗传转化体系的建立

摘要

多年生黑麦草（Lolium perenne L．）（perenial ryegrass）是一种优良的牧草和草坪草，其栽培品种繁多，广泛种植于世界各地。但由于自交不亲和，而导致利用传统方法对其进行遗传改良困难而复杂。生物技术尤其是转基因技术能够有效解决这一难题，并快速改善不良的靶基因性状。过去，针对于单子叶植物的遗传转化，主要采用基因枪法；随着转基因技术的日臻完善，农杆菌介导的遗传转化方法越来越多的被应用于单子叶植物之中。 本实验在研究黑麦草离体培养基础之上，着重对农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的多年生黑麦草高效遗传转化体系进行了研究，实验获得如下结果： （1）以6种多年生黑麦草夜影、畅通、绿宝石、顶峰、Nu Speed、A8393的成熟胚和生长点为外植体，在含有6种不同2，4-D浓度的MS培养基中诱导愈伤组织，发现5．0 mg/L2，4-D诱导两种外植体形成愈伤组织及胚性愈伤组织的效果最好，其中成熟胚的愈伤组织及胚性愈伤组织平均频率最高为50%和35%；生长点愈伤组织及胚性愈伤组织平均频率最高为60%和45%。 （2）不同黑麦草愈伤组织的分化频率不同，以夜影的分化频率最高，可达98%。另外，加有一定6-BA浓度的MS培养基有助于胚性愈伤组织的分化，当6-BA浓度为1．0 mg/L时愈伤组织的分化率最高，为87．5%。 （3）以继代14d左右的胚性愈伤组织为材料进行农杆菌介导的遗传转化，发现当农杆菌工程菌液浓度OD650为0．8时，GUS阳性发生率最高（57．3%）；添加200mmol/L乙酰丁香酮，侵染20min、共培养3d的抗性愈伤组织频率最高，为56%。 （4）使用不同浓度的两种脱菌剂-羧苄青霉素和Timentin对共培养愈伤组织进行脱菌处理，发现timentin在200mg/L浓度下抑菌效果达到100%，而羧苄青霉素至少应在250mg/L的浓度下才能有效脱菌。 （5）不同浓度的潮霉素对转化的愈伤组织交替筛选有助于获得转基因植株；以80 mg/L潮霉素筛选两周，50 mg/L潮霉素筛选两周，25 mg/L潮霉素筛选两周的效果最好。潮霉素筛选后将愈伤组织转入分化培养基且光照处理，30d后将获得转化植株。 （6）本实验共获得28个抗性转化植株，对其中夜影的11个抗性转化植株进行GUS染色，有8个植株呈现阳性反应，进一步的PCR检测证明，获得了4个含有Pcambia1305．1质粒的转基因植株。

目录

文摘

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论文说明：缩略词表

声明

第一章文献综述

1.引言

2.黑麦草离体再生体系的研究进展

2.1黑麦草遗传转化的受体系统

3.黑麦草遗传转化的主要方法

3.1直接转化原生质体

3.2基因枪转化法

3.3农杆菌转化法

3.4硅碳纤维介导法

3.5外源基因的表达调控

4.草坪草遗传转化中转基因细胞或植株的筛选和鉴定

4.1报告基因

4.2选择标记基因

4.3转基因草坪草的分子生物学检测

5.转基因技术在草坪草品种改良中的应用

5.1利用转基因技术对草坪草非生物胁迫抗性的改良

5.2利用转基因技术对草坪草生物胁迫抗性的改良

5.3利用转基因技术对草坪草除草剂抗性的改良

6.黑麦草遗传转化中存在的主要问题和展望

7.技术路线

7.1黑麦草胚性愈伤组织的诱导及再生体系的建立

7.2根癌农杆菌介导的黑麦草高效遗传转化体系的建立

8.本实验的研究目的和意义

第二章黑麦草愈伤组织的诱导及再生体系的建立

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与分析

2.1不同黑麦草品种种子发芽率的变化

2.2不同外植体类型对愈伤组织诱导的影响

2.3不同品种在不同浓度2,4-D下愈伤组织频率的变化

2.4黑麦草愈伤组织高效再生体系的建立

3.讨论

3.1外源激素对黑麦草愈伤组织诱导的影响

3.2外源激素对黑麦草愈伤组织分化的影响

3.3受体材料和外植体来源对牧草愈伤组织再生的影响

3.4其他因素对黑麦草愈伤组织诱导和再生的影响

4.小结

第三章农杆菌介导的黑麦草高效遗传转化体系的建立及转化植株的鉴定

1.材料与方法

1.1材料

1.2试剂和仪器

1.3菌株和载体

2.方法

2.1大肠杆菌感受态细胞的制各

2.2 pCAMBIA1305.1质粒向大肠杆菌感受态细胞中的转化

2.3大肠杆菌质粒DNA的提取(碱裂解小量提取法)

2.4农杆菌感受态细胞的制备

2.5 pCAMBIA1305.1质粒向农杆菌感受态细胞中的转化

2.6农杆菌介导的黑麦草遗传转化及转化苗的获得

3.转基因植株的分子鉴定

3.1黑麦草基因组DNA的提取

3.2 DNA纯度及浓度测定

3.3转基因植株鉴定

4.结果与分析

4.1农杆菌工程菌侵染液浓度的确立

4.2农杆菌侵染时间对转化率的影响

4.3共培养时间对抗性愈伤组织及转化植株频率的影响

4.4抗生素浓度对农杆菌的抑制反应

4.5筛选剂潮霉素浓度的确立

4.6转化植株的GUS及PCR鉴定

5.讨论

5.1抗生素的选择

5.2选择剂及选择压对转化的影响

5.3报告基因gus

5.4乙酞丁香酮对转化效率的影响

6.小结

参考文献

附 图

致谢

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