鸭甲型肝炎病毒RT——PCR检测方法的建立及华东地区2009-2011年鸭甲型肝炎病毒的流行病学调查

摘要

鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH)是危害养鸭业的一种急性高度致死性传染病。病原包括小RNA病毒科禽肝病毒属的鸭甲肝病毒(Duck hepatitis Avirus,DHAV)和星状病毒科禽星状病毒属的鸭星状病毒(Duck astrovirus,DAstV)。DHAV分为三个型,即1型(DHAV-1)、2型(DHAV-2)和3型(DHAV-3),分别对应以往所称的鸭肝炎病毒血清1型(DHV-1)以及2007年报道的台湾DHV新型和韩国DHV新型。
　　 为了解华东地区鸭肝炎病毒的流行情况,本研究建立了检测DHAV的RT-PCR方法,应用该方法检测了从江苏、山东、安徽地区采集疑似感染鸭病毒性肝炎临床样品,并对样品进行病毒分离鉴定、VP1基因遗传进化分析,为鸭病毒性肝炎的防控提供了快速检测方法和指导作用。
　　 1.鸭甲型肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立
　　 参考GenBank中已发表的DHAV-1和DHAV-3的全基因组序列,利用PrimerPremier5.0软件,针对VP1上、下游附近保守区域分别设计两对特异引物,建立了DHAV-1和DHAV-3的RT-PCR检测方法。用该方法对DHAV-1 YZ株和DHAV-3JD株进行检测,成功扩增出大小分别为720bp和950bp的目的条带,而与禽流感病毒、鸭瘟病毒、鸭疫里默氏杆菌无交叉反应,具有较好的特异性;能分别检测出RNA模板含量下限为5.2ng和6.8ng的DHAV-1和DHAV-3,具有较好的敏感性。因此该方法可用于DHAV的快速诊断和分子流行病学调查。
　　 2.2009-2011华东地区鸭甲型肝炎病毒的分离鉴定及遗传进化分析
　　 用该方法对临床疑似鸭肝炎病毒感染的病料进行检测,从15份病料中成功检测到15份DHAV-1和5份DHAV-3,因此,15份病料中有10份为DHAV-1单独感染,占66.7％;5份为DHAV-1和DHAV-3混合感染,占33.3％。病料经处理后通过鸭胚尿囊腔接种,得到15个分离株。以DHAV-1引物扩增15株DHAV VP1,并进行序列测定和绘制遗传进化树,结果表明所有毒株均与血清1型的参考毒株处于同一分支上,以DHAV-3引物扩增YN和DHV012个分离株的VP1,序列测定和绘制遗传进化树,结果表明这2个毒株与韩国DHAV-3及国内分离的DHAV-3同属于一个基因型。用己发表的针对3D基因序列的引物扩增这2个毒株,绘制的遗传进化树与VP1的一致。
　　 以鸡胚适应株YZ株制备的鸡抗DHAV-1阳性血清进行鸭胚中和试验,结果显示,抗血清对DHAV-1 SY株有较好的中和作用,而对DHAV-1和DHAV-3混合感染的YN株无任何中和作用,说明DHVA-1和DHAV-3存在明显的抗原差异性。
　　 综上所述,华东地区的鸭场存在2种血清型的流行株,即DHAV-1和DHAV-3,DHAV-1和DHAV-3的共感染问题进一步加剧了控制该病的困难。