胆固醇分子和PI3K/Akt及MAPK/ERK1/2信号通路在牛疱疹病毒1型感染MDBK细胞中的作用研究

摘要

牛疱疹病毒1型(Bovine herpesvirus type1,BoHV-1)是牛传染性鼻气管炎病(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)的病原体,该病毒感染主要引起呼吸道,消化道,生殖道,眼结膜和神经等多组织、器官的炎症;由该病毒感染引起呼吸道上皮细胞的坏死和免疫抑制导致继发曼氏溶血杆菌和睡眠嗜血杆菌感染的发生而致高死亡率,以及由于生殖道感染而导致的流产对奶牛养殖业造成巨大损失。潜伏感染是本病毒重要特点,感染后该病毒在神经节和扁桃体内潜伏感染使患牛终生带毒而成为重要传染源,在应激或免疫力下降时病毒被激活而发病,该病在世界各地广泛分布已经给养牛业带来巨大经济损失。
　　 病毒感染靶细胞的过程中需要一些重要细胞分子的帮助才能完成复制周期,同时病毒与细胞相互作用的过程中可能会激活或抑制细胞的某些重要的信号传导通路,因此开展相应的基础研究寻找BoHV-1感染MDBK细胞的过程中涉及的关键分子和信号通路,对于揭示病毒与细胞相互作用的关系,从而解析该病毒的感染机理,甚至对于新药物的研发设计都具有重要意义。
　　 Lipid rafts是大量分布于细胞膜上具有多种生物学功能的特定结构,主要由胆固醇、糖苷鞘磷脂、鞘磷脂和磷脂等成分紧密结合有序排列而构成;该结构稳定存在于脂质双层细胞膜上,主要参与跨膜运输、胞吞和胞吐过程中蛋白质的分选,细胞粘附和迁移,细胞凋亡,突触传递,细胞骨架的组织等多种生物学功能。最近研究发现Lipid rafts与多种病原微生物的感染有关,而胆固醇作为该结构的重要成分是否参与了BoHV-1感染MDBK细胞的过程值得探索并深入研究。
　　 胆固醇分子是Lipid rafts的主要成分,通过研究胆固醇可以锚定研究Lipidrafts的功能,Methyl-β-cyclodextrin(MβCD)能够有效去除细胞胆固醇分子,可以用于Lipid rafts功能研究。本研究发现采用MβCD处理MDBK细胞可以有效的降低细胞胆固醇含量,同时能够显著抑制病毒的复制,且该抑制作用具有剂量依赖性,MβCD处理的MDBK细胞经外源水溶性胆固醇分子恢复处理后,可以部分回复病毒的复制功能,使病毒滴度增加,这表明细胞胆固醇分子的部分去除是造成该病毒滴度下降主要原因,进一步研究发现在病毒感染侵入后的阶段去除胆固醇分子对病毒的滴度影响不显著,胆固醇分子的去除并不影响病毒与MDBK细胞的结合。从病毒方面因素来考虑,采用MβCD处理病毒而降低囊膜胆固醇分子的含量也能导致病毒感染力下降,当补加外源性胆固醇分子时该抑制效应可以被部分抵消,可见胆固醇分子对于病毒的感染力具有重要作用。综上研究结果表明细胞膜胆固醇分子对于BoHV-1侵入靶细胞具有重要作用,而病毒囊膜胆固醇分子对于该病毒的感染力具有重要意义,这为深入研究该病毒致病机理打下基础。由于Lipid rafts内含有多种分子参与了细胞相关信号传导,我们推测胆固醇分子的去除,破坏了一些信号分子发挥作用的环境,导致病毒侵入的某些环节被阻断,鉴于目前BoHV-1感染的过程中激活了那些信号通路尚未见相关报道,所以该推论需要研究证实。
　　 Phosphatidylinositol3-kinases/Akt(P13K/Akt),信号通路是执行多种生物学功能的信号调控系统,即在P13K的调节下Akt通过调节多种蛋白分子的活性来执行P13K调控的多种生理学反应,如细胞存活和细胞增殖,血管生成,代谢调控和细胞迁移等。丝裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)超家族能够将接受的多种刺激信号跨膜传递到细胞核执行相应的生物学功能,细胞外信号调节激酶1和2(Extracellular signal-regulated kinases1 and2,Erk1/2)作为MAPK超家族的成员参与调节多种细胞生物学功能如细胞增殖、细胞转化、细胞分化、细胞存活和死亡等过程。BoHV-1感染MDBK细胞的过程中是否需要该P13K/Akt和MAPK/Erk1/2信号通路的参与尚不清楚。
　　 本研究发现BoHV-1感染MDBK细胞的过程中能够激活Akt和Erk1/2,包括感染的早期短暂激活和晚期持续性激活,且经紫外线灭活的病毒仍然能够在感染的早期激活Akt和Erk1/2而不能在晚期激活Akt和Erk1/2,表明病毒与细胞结合和/或侵入的过程中能够激活Akt和Erk1/2,后期Akt和Erk1/2的持续性激活与病毒基因表达的过程有关;病毒诱导的Akt激活可以被P13K抑制剂Ly294002特异性阻断,病毒诱导的Erk1/2激活可以被MAPK激酶(MAPK kinase,MEK1/2)的抑制剂U0126所抑制,这表明Akt和Erk1/2的上游激活子分别是P13K和MEK1/2。此外用Akt的抑制剂Ly294002处理MDBK细胞导致病毒滴度下降1.5log,表明P13K的激活对于病毒的复制具有重要意义,而MEK1/2的抑制剂处理细胞后病毒滴度无明显变化,表明抑制MAPK/Erk1/2信号通路不影响病毒的复制;进一步研究发现P13K的激活对于该病毒的复制周期中侵入后阶段影响显著,尽管病毒与细胞结合即可激活该P13K/Akt信号通路,但是抑制P13K的活性并不影响病毒与细胞的结合,同样在侵入阶段抑制P13K的活性对于该病毒的复制影响不显著;本研究首次阐明在BoHV-1感染MDBK细胞的过程中能够激活P13K/Akt和MAPK/Erk1/2两个信号通路,特别是P13K的激活对于病毒复制周期的侵入后阶段具有重要意义。
　　 Lipid rafts形成一个疏水性微环境,可能是多种分子相互作用的位点和场所,我们前期的研究发现胆固醇分子参与BoHV-1感染MDBK细胞的侵入过程,而在该病毒侵入和/或结合靶细胞的过程中又能激活P13K/Akt和MAPK/Erk1/2两个信号通路,但是该信号通路的早期激活过程是否受胆固醇分子的影响并不清楚,本试验发现降低细胞表面胆固醇含量对该病毒诱导的P13K/Akt和MAPK/Erk1/2早期激活影响不显著。
　　 本研究首次阐明在BoHV-1感染MDBK细胞的过程中需要细胞胆固醇分子的参与才能有效的完成侵入过程,在感染的早期和晚期都能激活P13K/Akt和MAPK/Erk1/2两个信号通路,且P13K/Akt通路的激活对于该病毒复制具有重要意义,而细胞表面胆固醇含量的降低对该病毒诱导的P13K/Akt和MAPK/Erk1/2早期激活影响不显著。