弯曲菌real-time PCR技术的建立及多种定量检测方法的比较

摘要

弯曲菌（Campylobacter spp）是一种重要的食源性病原菌，近几年由弯曲菌引起的急性腹泻病例呈较快上升趋势。研究表明，在人类感染弯曲菌散发病例中，超过90％的病例是由于食用了污染的鸡肉产品及其交叉污染物所致。我国已大体了解了不同宿主及食品中弯曲菌的污染状况，但流行病学定性研究结果提供的干预措施不能量化，获得的政策建议不够精确。因此，需要开展快速、定量的检测方法研究，为弯曲菌污染的定量风险评估、危害分析和防控提供基础数据。
　　1、弯曲菌real-time PCR定量检测方法的建立
　　以弯曲菌16s rRNA基因作为靶基因，建立检测弯曲菌的real-time PCR方法。弯曲菌标准株、分离株均扩增出曲线，而其他常见食源性病原菌均无扩增，表明该方法具有较强的特异性。敏感性试验结果显示，该方法对弯曲菌检测限在10CFU/mL左右。荧光定量PCR方法标准曲线循环阈值（Ct值）与模板浓度具有良好的线性关系，标准曲线为:y=-3.286x+40.878，R2值达到0.999，批内可重复变异系数在0.12％-0.4％之间，批间可重复变异系数为0.17％，重复性好。对样品分别使用样品直接热裂解法、菌液浓缩热裂解法和基因组试剂盒提取法提取模板DNA，并对不同制备方法的荧光定量PCR结果进行了比较，最终选用菌液浓缩热裂解法提取鸡肉擦拭样品和鸡肛拭样品模板DNA，弯曲菌DNA回收率分别为46％和19.6％，选用基因组试剂盒提取鸡肉淋洗样品模板DNA，该方法的DNA回收率为1.2％。
　　2、选择性CCDA平板菌落计数法和选择性Karmali平板菌落计数法的优化
　　本研究参照翟伟华等建立的禽肉中弯曲菌定量检测方法，对选择性CCDA平板中抗生素进行浓度调整，并比较添加三种不同抗生素浓度的平板对实际样品中弯曲菌检测的影响，结果表明，甲氧苄氨嘧啶、利福平和放线菌酮三种抗生素浓度调整为0.01 g/L、0.01 g/L和0.1 g/L时，更有利于弯曲菌的生长，且平板上杂菌的量也不影响对弯曲菌可疑菌落的判定，采用该浓度抗生素平板与纯培养弯曲菌的符合度为（95±5）％。
　　选择性Karmali平板菌落计数法参照《我国零售鸡肉中弯曲菌污染对人群健康影响的初步定量风险评估项目》中所采用的定量分离样品中弯曲菌方法，通过实际样品检测以验证其有效性。
　　3、real-time PCR法、选择性CCDA和Karmali平板菌落计数法检测整鸡淋洗样品中弯曲菌的比较
　　运用荧光定量PCR方法、CCDA平板菌落计数法和Karmali平板菌落计数法同时对50份鸡肉淋洗样品进行弯曲菌检测。荧光定量PCR方法检测阳性率为92％，检测出弯曲菌数平均值为log2.03CFU/g，与国标方法符合率为28.0％; CCDA平板菌落计数法检测阳性率为36％，检测出弯曲菌数平均值为log1.44 CFU/g，与国标方法符合率为60.0％; Karmali平板菌落计数法检测阳性率为56％，检测出弯曲菌数平均值为log2.08CFU/g，与国标方法符合率为56.0％。由于国标方法存在漏检现象，导致三种方法与国标方法符合率均不高。结果显示real-time PCR法阳性检测率高于选择性CCDA平板菌落计数法和Karmali平板菌落计数法，但与国标方法符合率最低;对于鸡淋洗样品而言，Karmali平板菌落计数法阳性检出率和阳性样品弯曲菌数均显著高于CCDA平板菌落计数法。
　　4、real-time PCR法和CCDA平板菌落计数法检测鸡肉擦拭和鸡肛拭样品中弯曲菌的比较
　　运用荧光定量PCR方法和CCDA平板菌落计数法对扬州某农贸市场采集的68份鸡肉擦拭样品进行弯曲菌检测。实时荧光定量PCR检测出弯曲菌阳性样品65份，阳性率为95.6％(65/68)，检测出弯曲菌数平均值为log2.36CFU/100cm2;选择性CCDA平板菌落计数法检测出弯曲菌60份阳性，阳性率为88.2％(60/68)，检测出弯曲菌数平均值为log1.25CFU/100cm2。结果显示两种方法的符合度为89.7％，且real-time PCR法阳性检测率及阳性样品弯曲菌数均高于选择性CCDA平板菌落计数法。
　　运用荧光定量PCR方法和CCDA平板菌落计数法对扬州某农贸市场采集的56份鸡肛拭样品进行弯曲菌检测。实时荧光定量PCR检测出弯曲菌阳性样品54份，阳性率为96.4％(54/56)，检测出弯曲菌数平均值为log6.02CFU/g;选择性CCDA平板菌落计数法检测出弯曲菌42份阳性，阳性率为75.0％(42/56)，检测出弯曲菌数平均值为log3.50CFU/g。结果显示两种方法的符合度为78.8％，且real-time PCR法阳性检测率及阳性样品弯曲菌数均高于选择性CCDA平板菌落计数法。
　　5、CCDA平板菌落计数法和Karmali平板菌落计数法检测鸡肛拭样品中弯曲菌的比较
　　运用选择性CCDA平板菌落计数法和Karmali平板菌落计数法对18份鸡肛拭样品进行弯曲菌检测。选择性Karmali平板菌落计数法检测出9份阳性，阳性率为50％，检测出弯曲菌数平均值为log6.02CFU/g; CCDA平板菌落计数法检测出13份阳性，阳性率为72.2％，检测出弯曲菌数平均值为log6.06 CFU/g。结果显示出对于鸡肛拭样品而言，虽然这两种方法检测阳性样品弯曲菌数没有显著差异，但CCDA平板菌落计数法阳性检测率高于选择性Karmali平板菌落计数法。