南蛇藤提取物抑制人肝癌细胞HepG2转移的相关机制研究

摘要

肝癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，手术切除是其首选治疗手段，但术后转移复发是制约远期疗效的重要因素之一。近年来研究发现，肿瘤转移是一个多步骤的复杂过程，包括肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移与粘附等。 有许多信号转导通路参与了肿瘤细胞的转移过程的调控，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（Phosphatidylinositol-3-kinase/Protein Kinase B，PI3K/Akt）信号通路作为细胞内重要信号转导通路之一，通过影响下游多种效应分子的活化，在细胞内发挥着抑制凋亡、促进增殖的关键作用，与人类多种肿瘤的发生及发展密切相关。有文献表明PI3K/Akt信号通路可能通过促进肿瘤细胞内核转录因子κB(Nuclear Factor Kappa B，NF-κB)、基质金属蛋白酶-2（Matrix Metalloproteinase-2，MMP-2）和基质金属蛋白酶-9（Matrix Metalloproteinase-9，MMP-9）的表达，进而促进肿瘤细胞的侵袭及迁移。 南蛇藤（Celastrus orbiculatus Thunb.）广泛分布于我国，功效祛风、除湿等。我课题组前期体内外研究发现，南蛇藤提取物（Celastrus orbiculatus extracts，COE）有显著的抗肿瘤作用，但具体作用机制并不十分明确。本研究对COE体外抗人肝癌HepG2细胞的作用及相关机制进行了研究。 目的:研究COE对人肝癌HepG2细胞增殖、侵袭与迁移能力的影响，并进一步探讨相关分子机制。 方法:不同浓度COE（20、40、80、160、320μg/mL）处理人肝癌HepG2细胞24 h或48 h后，MTT法分析COE对细胞增殖能力的影响;并在倒置显微镜下观察细胞形态变化;Transwell小室法检测各药物浓度对HepG2细胞的侵袭及迁移能力的影响;Western blot法检测HepG2细胞PI3K/Akt信号通路相关蛋白、NF-κB p65、MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平。 结果:不同浓度COE作用24 h后，20、40、80、160及320μg/mL COE对HepG2细胞增殖抑制率分别为11.74±2.95，12.59±3.16，19.59±3.02，51.94±7.30及58.56±11.83，与阴性对照组1.37±12.04相比，各组均有显著差异(P＜0.05或P＜0.01)，药物作用48 h后，20、40、80、160及320μg/mL COE对HepG2细胞增殖抑制率分别为18.57±9.89，27.11±10.12，39.62±7.63，70.80±3.74及77.27±2.91，与对照组1.99±13.68相比，各组均有显著差异（P＜0.05或P＜0.01）。说明COE对HepG2细胞的增殖有抑制作用，并呈时间剂量依赖性。 不同浓度20、40、80、160及320μg/mL的COE作用细胞48 h后，倒置显微镜下观察各组细胞形态变化，结果显示，与对照组相比，COE药物组贴壁的细胞数目随着药物浓度的增加而减少，细胞呈现出凋亡的形态特征。 药物作用24 h后，Transwell小室法检测细胞侵袭结果表明，与阴性对照组相比，COE药物组能不同程度的降低细胞穿膜数目，有显著差异(P＜0.05或P＜0.01);Transwell小室法检测细胞迁移结果显示，视野中小室底膜贴壁的人肝癌HepG2细胞数目随着COE药物剂量的增加而减少，与对照组109±3.61相比，有显著差异(P＜0.05或P＜0.01)。综合上述结果，说明COE能抑制HepG2细胞的侵袭及迁移能力。 加入不同浓度COE（20、40、80、160μg/mL）处理对数生长期HepG2细胞24 h后，Western blot分析，结果显示，与对照组相比，COE对Akt的表达影响不明显，但能明显抑制p-Akt、NF-κB p65、MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平。 结论:COE能抑制人肝癌HepG2细胞增殖、侵袭及迁移能力，其机制可能与下调PI3K/Akt信号通路、NF-κB p65、MMP-2及MMP-9蛋白的表达有关。

目录

摘要

符号说明

前言

1．材料

1．1 药品

1．2 细胞

1．3 试剂

1．4 Western blotting实验主要试剂

2 实验方法

2．1 细胞培养

2．2 MTT分析

2．3 细胞形态

2．4 细胞侵袭实验

2．5 细胞迁移实验

2．6 Western blotting分析

2．7 统计学分析

3．结果

3．1 COE抑制HepG2细胞的增殖

3．2 COE改变HepG2细胞的形态

3．3 COE抑制HepG2细胞的侵袭力

3．4 COE抑制HepG2细胞的迁移能力

3．5 侵袭与迁移实验的区别及目的

3．6 COE对人肝癌HepG2细胞中PI3K／Akt信号通路影响

3．7 COE对人肝癌HepG2细胞中NF-κB p65、MMP-2及MMP-9蛋白表达的影响

讨论

参考文献

文献综述：中药活性成分抗肝癌分子机制研究进展

攻读学位期间取得的科研成果

致谢

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