H5、H7和H9亚型禽流感病毒快速检测方法的建立

摘要

禽流感(Avian Influenza，AI)是由A型流感病毒引起的家禽一种疾病和感染，该病毒亚型众多，宿主范围广，易发生变异和重组。近年来，禽流感频繁爆发，不仅给养殖业造成了重大的经济损失，而且对人类的健康也构成了巨大的威胁。其中，危害较大的主要有H5、H7和H9亚型禽流感。为了及时诊断禽流感病毒感染，采取相应的防控措施，迫切需要建立一种快速检测禽流感病毒的方法。本研究采用一步法多重RT-PCR技术建立了禽流感病毒H5、H7和H9亚型快速诊断方法，制备了针对禽流感H5N1和H7N9亚型的单克隆抗体，并在此基础上，研制出检测H7N9亚型禽流感病毒的免疫胶体金试纸条。
　　1 H5、H7和H9亚型禽流感病毒一步法多重RT-PCR方法的建立
　　针对禽流感病毒M基因序列设计合成了1对AIV通用引物，针对H5、H7和H9亚型的HA基因分型设计合成了3对型鉴定引物。采用一步法多重RT-PCR技术建立禽流感病毒的快速分型诊断方法，并对其特异性和敏感性进行验证。结果表明，M基因和H5、H7、H9 AIV的HA基因的扩增产物大小分别为300 bp、173 bp、525 bp和378 bp，与预期的大小一致。对照组中的H1，H4，H6，H10，H11，NDV，IBV扩增均为阴性;其灵敏度高，将病毒RNA稀释到10 ng/ mL后，仍可扩增出特异性条带。应用所建立的一步法多重RT-PCR方法检测30份病料，鉴定结果与病毒分离后的血凝抑制试验的一致。
　　2 H5N1和H7N9亚型禽流感病毒单克隆抗体的研制
　　选择H5N1亚型和H7N9亚型禽流感病毒的代表株C18和JT。全病毒用蔗糖密度梯度纯化浓缩后免疫6-8周龄的Balb/c母鼠，通过传统ELISA方法结合血凝抑制法筛选阳性克隆，最终得到了10株能稳定分泌抗体的单抗杂交瘤细胞株，其中4株为针对H5亚型禽流感病毒的单抗，分别命名为1C4、5E10、1G11、6F4;6株为针对H7亚型禽流感病毒的单抗，分别命名为3D8，5D4，3E4，4F4，6C5，3G5。特异性结果显示，得到的10株腹水与H9、NDV和IBV都不反应。血凝抑制试验显示，5E10和1G11对C18有血凝抑制作用;4F4和6C5对JT有血凝抑制作用。Western-blot结果显示，1C4和6F4对C18有反应，均在55KD左右出现一条特异性条带。间接免疫荧光试验结果显示，1C4、5E10、1G11和6F4对C18产生特异性的荧光反应，同时1C4和6F4还与H5亚型禽流感病毒不同分支的病毒SY、LK、HA产生特异性的荧光反应，1C4和6F4反应较广谱。4F4和6C5对JT产生特异性的荧光反应。
　　3 检测禽流感H7N9亚型胶体金试纸条的研制
　　通过柠檬酸三钠还原方法制备胶体金，试纸条采用双抗体夹心原理，将6C5单抗标记的胶体金-抗体复合物以1∶10稀释度包被于金标垫上;将抗鸡多克隆抗体以1 mg/mL的浓度包被于检测线，羊鼠IgG以1.5 mg/mL的浓度包被于NC膜的质控线。当检测样品中含有H7N9亚型病毒是两条线均显色，而不含有H7N9亚型病毒时就只有质控线显色。特异性实验表明，试纸条可检测H7N9亚型病毒，与其它亚型禽流感病毒及其它禽类病毒均没有交叉反应。广谱性检测表明，此试纸条可与所检测的H7N9亚型病毒均反应。用H7N9病毒尿囊液作为检测原时，敏感性可以达到检测24个血凝单位的病毒。

目录

摘要

符号说明

综述 禽流感病毒及其检测方法的研究进展

参考文献

第一章 H5、H7和H9亚型禽流感病毒一步法多重RT-PCR方法的建立

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二章 H5和H7亚型禽流感病毒单克隆抗体的研制

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第三章 H7N9亚型禽流感病毒胶体金试纸条的研制

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

全文小结

致谢

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