肠炎沙门菌sipA缺失株的构建及SipA蛋白促炎效应初步研究

摘要

肠炎沙门菌(Salmonella enterica serovar Enteritidis, SE)是革兰阴性、兼性胞内寄生菌，主要寄生在人和动物的肠道，可引起胃肠炎甚至严重的全身性感染，是重要的人兽共患病病原菌。由SPI-1和SPI-2编码的Ⅲ型分泌系统(T3SS)是沙门菌致病重要的毒力因子之一，T3SS的效应蛋白在细菌致病过程中发挥多重功能。目前针对这些效应蛋白的研究主要以鼠伤寒沙门菌为模型，在肠炎沙门菌中的功能研究鲜有报道。鼠伤寒沙门菌SipA是由与侵袭相关的T3SS-1分泌至宿主细胞的效应蛋白。SipA蛋白通过羧基端调节细胞肌动蛋白骨架结构促进沙门菌侵袭肠上皮细胞，通过氨基端激活肠上皮细胞的信号通路，引起肠道的炎症。本研究采用λ-Red同源重组技术构建肠炎沙门菌sipA基因缺失株，探讨了sipA与肠炎沙门菌致病性的关系，为进一步研究肠炎沙门氏菌感染过程中sipA基因的功能奠定基础。
　　1、肠炎沙门菌SipA蛋白的原核表达及肠炎沙门菌C50336ΔsipA缺失株的构建与鉴定
　　本研究利用重组DNA技术构建原核表达质粒pET30a(+)-sipA，并将其导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，通过IPTG的诱导，表达了肠炎沙门菌C50336的效应蛋白SipA。SDS-PAGE结果显示，重组蛋白SipA以可溶性的形式表达，并且蛋白大小与预期一致。将纯化的SipA蛋白免疫BALB/c小鼠后制备其多抗血清。
　　利用λ-Red同源重组系统对肠炎沙门菌sipA基因进行了敲除，成功构建肠炎沙门菌C50336的sipA基因缺失株。将sipA基因克隆至回复质粒pBR322后电转化缺失株中，构建回复株C50336ΔsipApsipA。用制备的多抗血清作一抗，Western blot检测SipA蛋白体外表达情况，结果显示SipA蛋白能在体外培养条件下表达。比较野生株C50336、缺失株C50336ΔsipA及回复株C50336ΔsipApsipA的基本生物学特性及毒力。结果显示:sipA基因的缺失不影响C50336的生长特性、生化特性以及毒力，且缺失株具有良好的遗传稳定性。肠炎沙门菌sipA基因缺失株的成功构建为后期研究sipA基因在肠炎沙门菌致病过程中发挥的作用提供了相应的生物材料。
　　2、肠炎沙门菌SipA蛋白促炎效应的初步研究
　　对肠炎沙门菌野生株C50336、缺失株C50336ΔsipA及回复株C50336ΔsipApsipA进行Caco-2细胞黏附和侵袭实验。结果表明sipA基因缺失不影响肠炎沙门菌的黏附能力，但引起细菌侵袭能力降低。分别将野生株、缺失株及回复株侵袭Caco-2 BBE细胞0.5 h，Western blot及激光共聚焦显微镜鉴定细胞凋亡蛋白Bax的表达情况，并测定细胞凋亡情况。结果显示，sipA基因缺失株引起细胞的促凋亡蛋白Bax表达下调，且细胞发生凋亡的比例显著降低。
　　构建重组真核表达质粒pcDNA3.1 flag-sipA并瞬时转染HEK293T细胞，经间接免疫荧光鉴定，SipA在HEK293T细胞得到表达。将真核表达质粒pcDNA3.1 flag-sipA分别瞬时转染HEK293T、HeLa细胞后利用荧光素酶报告基因检测系统分析NF-κB的转录激活活性。将野生株、缺失株及回复株感染已转染荧光素酶报告载体(pGL4.32)的HeLa细胞，荧光素酶报告基因检测系统分析NF-κB的转录激活活性。结果显示，真核表达pcDNA3.1 flag-sipA瞬时转染HEK293T、HeLa细胞后，与空载体转染结果相比，两种细胞的NF-κB活性显著上调。与野生株和回复株相比，sipA基因缺失株引起HeLa的NF-κB活化程度显著降低。从蛋白和细菌两个水平说明SipA能够活化NF-κB信号通路。
　　将野生株、缺失株、回复株口服感染链霉素处理的C57BL/6小鼠进行组织切片的观察以及血清中细胞因子的测定。组织切片结果显示，缺失株感染组肝脏、结肠、盲肠的病理变化程度轻于野生株和回复株感染组。与野生株和回复株相比，缺失株感染组血清中IL-6、MCP-1、TNF-α和IFN-γ显著降低，说明SipA蛋白为肠炎沙门菌的促炎性效应蛋白，可促使宿主肠道炎症的产生。本研究初步阐明sipA基因在肠炎沙门菌引发宿主炎症反应过程中发挥作用。

目录

摘要

符号说明

综述 沙门菌毒力岛编码的Ⅲ型分泌系统、效应蛋白功能的研究进展

1 沙门菌毒力岛及Ⅲ型分泌系统

2 效应蛋白介导沙门菌对肠上皮细胞的侵袭

3 沙门菌效应蛋白参与的炎症相关信号通路

4 结语

参考文献

第一章 肠炎沙门菌SipA蛋白的表达及sipA基因缺失株的构建与鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第二章 肠炎沙门菌SipA蛋白促炎效应的初步研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文

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