含有pdmH1N1/09内部基因的H9N2重组病毒在豚鼠间传播特性和小鼠致病性的研究

摘要

气溶胶传播途径作为流感病毒高效的传播途径已经引起了广泛的关注。2009年大流行H1N1流感病毒(pdmH1N1/09)能够通过气溶胶传播途径在雪貂和豚鼠进行有效的传播并且能够引起人类的死亡。通过反向遗传技术，人们发现pdmH1N1/09的基因片段与其他亚型的禽流感病毒(Avian influenza viruses，AIVs)和季节性流感病毒的基因片段具有很好的适配性。已有的研究也表明含有pdmH1N1/09 PA和NS基因的高致病性H5N1禽流感病毒(H5 HPAIV)能获得在雪貂间的气溶胶传播能力。
　　在我国H9N2亚型AIVs从20世纪90年代末开始流行，并偶尔发生感染哺乳动物的病例。流行病学数据分析发现H9N2亚型AIVs血凝素蛋白(HA)的第226位氨基酸为L的毒株数量越来越含优势，受体结合能力实验也表明H9N2亚型AIVs能结合哺乳动物的受体。此外，PB2片段上627位氨基酸的“人源化”，也为H9N2亚型AIVs在哺乳动物间进行高效的气溶胶传播提供了必要的条件。更为重要的是，已有的研究表明自然界分离的H9N2毒株已获得在雪貂间的气溶胶传播能力。
　　H9N2亚型AIVs和pdmH1N1/09病毒可同时在同一地区甚至同一动物中分离到，例如猪、犬和猫中，这样大大增加了它们进行重组的可能。此外，目前新出现的H7N7、H7N9、H10N8以及H5N2等一些病毒的内部基因均来源于H9N2亚型AIVs。因此，研究H9N2 AIVs和pdmH1N1/09重组的可能性以及重组病毒的传播特性和致病特性对于流感大流行的预警有重要意义。
　　本实验室之前的研究结果证明了携带H9N2亚型AIVs的两个外部基因以及pdmH1N1/09六个内部基因的重组H9N2亚型AIVs能获得在豚鼠间的气溶胶传播能力。然而，我们尚不清楚pdmH1N1/09的哪个或者哪些内部基因影响重组H9N2流感病毒的气溶胶传播能力。在本研究中，我们拯救了一系列的重组H9N2流感病毒，并对其传播性能和致病性进行了探索。我们发现NP、M和NS这三个片段的共同作用能使重组的H9N2病毒获得在豚鼠间的高效气溶胶传播能力，并且同时也能增强重组病毒对小鼠的毒力。
　　1、H9N2重组病毒的拯救及其在豚鼠间传播能力的测定
　　我们首先对2007年至2013年华东地区的H9N2亚型AIVs的八个基因进行了遗传进化分析，发现当前H9N2 AIVs的优势基因型为S基因型。同时将已经发表的与pdmH1N1/09重组的H9N2流感病毒与本室的分离株进行了序列比对分析，并绘制进化树。我们发现华东地区的H9N2地方流行株与已发表选用的H9N2亚型AIVs存在较大差异。因此，我们选择实验室分离的华东地区优势流行株A/Chicken/Jiangsu/Wujin/57/2012(WJ57)和pdmH1N1/09的代表株A/Ca1ifornia/04/2009(CA/04)作为构建系列重组病毒的母本病毒。
　　首先，我们拯救了含有WJ57 HA和NA基因以及CA/04的内部基因的H9N2重组病毒[W(HA+NA)-C]，并测定了该重组病毒及其母本病毒WJ57和CA/04的传播性能。结果显示W(HA+NA)-C重组病毒获得了在豚鼠间的高效气溶胶传播能力。然后，我们以W(HA+NA)-C为骨架，将WJ57的内部基因逐个替换上去，发现当将NP、M和NS这三个基因单独替换到H9N2重组病毒W(HA+NA)-C时[即:W(NP+HA+NA)-C、W(M+HA+NA)-C、W(NS+HA+NA)-C]，这些重组病毒丧失了在豚鼠间的气溶胶传播能力。这些结果表明CA/04的NP、NS和M基因对于重组病毒在豚鼠间的气溶胶传播能力非常关键。因此，接下来我们分别将CA/04的M、M+NS、NP+M+NS替换至WJ57骨架上，并测定了重组病毒的传播性能。结果显示，只有当CA/04的三个内部片段NP、M和NS同时替换到WJ57上时，重组的H9N2病毒C(NP+M+NS)-W才具有气溶胶传播能力。并且C(NP+M+NS)-W和W(HA+NA)-C气溶胶传播组的豚鼠呈现出高滴度的排毒。
　　2、H9N2重组病毒在小鼠中的致病能力测定
　　基于以上研究结果，我们进一步评价了CA/04、WJ57、W(HA+NA)-C、W(HA+NA+NP)-C、W(HA+NA+M)-C、W(HA+NA+NS)-C和C(M+NS+NP)-W重组病毒在体内外的复制能力以及对小鼠的致病力。结果显示，C(M+NS+NP)-W重组病毒在哺乳动物细胞中的复制能力以及对小鼠的致病性都要强于其母本病毒WJ57。而W(HA+NA+NP)-C、W(HA+NA+M)-C和W(HA+NA+NS)-C在这方面要弱于其母本病毒CA/04。以上研究结果表明重组的H9N2病毒不仅可获得在豚鼠间的气溶胶高效传播能力还能获得对哺乳动物更强的致病性。

目录

摘要

符号说明

综述 H9N2亚型禽流感病毒的现状

1、目前的流行情况

2、在鸡群中的临床症状

3、抗原漂变情况

4、遗传和生物学进化

5、跨种间传播

6、小结

参考文献

第一章 H9N2重组病毒的拯救及在豚鼠间传播能力的测定

1、材料方法

1．1 生物材料

1．2 主要生物试剂与仪器

1．3 实验动物

1．4 SPF鸡红细胞

1．5 血清学实验

1．6 病毒的分离鉴定

1．7 重组病毒的拯救

1．8 重组病毒传播能力的测定

1．9 鸡胚半数感染量(EID50)

2、结果

2．1 病毒基因分析结果

2．2 重组病毒的拯救鉴定

2．3 母本病毒与亲本病毒气溶胶传播能力的测定

2．4 单替换重组病毒传播能力的测定

2．5 反向基因替换重组病毒的拯救

2．6 反向基因替换重组病毒传播特性的测定

2．7 母本病毒与重组病毒排毒能力的测定

3、讨论

参考文献

第二章 H9N2重组病毒在小鼠中的致病能力测定

1、材料与方法

1．1 生物材料

1．2 主要试剂和仪器

1．3 实验动物

1．4 病毒序列测定

1．5 SPF鸡红细胞

1．6 血清学实验

1．7 病毒繁殖能力

1．8 小鼠致病性试验及体内复制能力试验

2、结果

2．1 体外复制能力

2．2 病毒的致病力

2．3 小鼠体内增殖能力

3、讨论

参考文献

全文小结

附录

致谢

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