H6N1亚型AIV在豚鼠间传播能力及H9N2亚型AIV对小鼠致病性研究

摘要

禽流感病毒的自然宿主是水禽，通常仅能感染鸡、火鸡、鸭、鹅、野鸟和水禽等宿主，具有种属特异性，很难突破宿主屏障感染哺乳动物和人类。然而，近几年越来越多的事件表明，低致病性禽流感病毒能够跨越种间屏障，感染人和哺乳动物，对人类的安全构成威胁。因此，像H6和H9亚型的低致病性禽流感病毒越来越引起人们的关注。本文实验内容及结果，为研究低致病性禽流感病毒跨越种间屏障，对哺乳动物致病，以及在哺乳动物间传播的分子机制奠定了基础。
　　本文应用豚鼠模型，评价一株H6N1亚型禽流感病毒的接触传播能力。A/mallard/Sanjiang/275/2007既能结合SAa-2，3Gal受体，又能结合SAa-2，6Gal受体;M-275能够在豚鼠的上呼吸道复制，在鼻甲骨的复制能力最强，平均滴度为1.5LogEID50/mL～2.5LogEID50/mL，豚鼠的肝脏、脾脏、脑、肠道、肺脏和肾脏都未检测到病毒;M-275能够引起豚鼠肺脏发生病变，但豚鼠在14d观察期内未表现任何临床症状;此株禽流感病毒M-275不能在豚鼠间接触传播。
　　M-275在豚鼠体内连续性传代，传播至第七代和第十八代后，病毒仍不能够在豚鼠间传播;传至第十八代得到的病毒M-275-P18-M2对小鼠的致病力明显增强，MLD50为105.25EID50，106EID50的攻毒量对小鼠的致死率是100％，原代毒株对小鼠不致死;根据对传代病毒M-275-P2-E1、M-275-P7-M1、M-275-P16-M1和M-275-P18-M2的全基因测序结果得出，PB2 D701N、PB1 Q687R、HA G122E、NA W233C、M1 D94N、M1Q211R这六个突变位点可能都与病毒在哺乳动物间传播能力的增强无关;而PB2D701N位点的突变，可能是M-275-P18-M2对小鼠致病力增强的原因。
　　本文还将一株H9N2亚型AIV在小鼠的肺脏进行传代，得到鼠肺适应株JN-P9-2-M1;JN-P9-2-M1对小鼠的致病性明显提高，其MLD50为103.5EID50，106EID50、105EID50、104EID50的攻毒剂量的小鼠幸存率是0，比原毒提高了至少1000倍，原毒对小鼠不致死;JN-P9-2-M1在豚鼠间的传播能力也有了一定的提高，可以偶然在豚鼠间接触传播，原毒JN不能在豚鼠间传播;根据对传代病毒JN-P5-2-M1和JN-P9-2-M1的全基因测序结果，PB2 E627K、HA N313D和HA N496S三个位点可能是病毒对小鼠致病力初步提高的原因，而PA L342I和NA N218T这两个点突变，就有可能是进一步提高病毒对小鼠致病力的关键位点。
　　成功构建H9N2强毒株JN-P9-2-M1的反向遗传操作平台，拯救病毒rJN-P9-2-M1的生物学特性同亲本毒株JN-P9-2-M1一致。利用该平台，可以进一步筛选导致JN-P9-2-M1对小鼠表现为高致病性的关键位点，为进一步研究H9N2亚型禽流感病毒致病性变异的分子机制提高了条件。

目录

摘要

1 绪论

1．1课题背景

1．2 流感病毒的结构与分类

1．2．1 流感病毒概念与分类

1．2．2 A型流感病毒的基因组结构及其编码的蛋白质功能

1．3 流感病毒传播的研究进展

1．3．1 流感病毒传播的哺乳动物模型

1．3．2 影响流感病毒传播的关键氨基酸位点

1．3．3 流感病毒能够进行空气传播的条件

1．3．4 野生鸟类在流感病毒传播中的作用

1．4 A型流感病毒致病性变异研究进展

1．4．1 血凝素HA蛋白对致病性的影响

1．4．2 神经氨酸NA蛋白对致病性的影响

1．4．3 碱性聚合酶蛋白2对致病性的影响

1．4．4 非结构蛋白NS1对致病性的影响

1．5 本研究的目的和意义

2 H6N1亚型AIV在豚鼠体内复制与传播能力评估

2．1 材料

2．1．1 毒株

2．1．2 实验动物

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要仪署

2．2 方法

2．2．1 测定M-275的受体结合特性

2．2．2 M-275鸡胚半数量染量(EID50)测定

2．2．3 H6N1亚型AIV在豚鼠体内的复制

2．2．4 H6N1亚型AIV在豚鼠间水平传播能力评估

2．2．5 豚鼠鼻洗液与脏器的病毒滴定

2．2．6 豚鼠血清HI抗体检测

2．3 结果

2．3．1 受体结合特性分析

2．3．2 鸡胚半数感染量(EID50)结果

2．3．3 H6N1亚型AIV在豚鼠体内的复制结果

2．3．4 豚鼠肺脏的病理切片和免疫组化结果

2．3．5 H6N1亚型AIV在豚鼠间水平传播实验结果

2．3．6 豚鼠血清HI抗体测定结果

2．4 讨论

2．5 本章小结

3 H6N1亚型AIV在豚鼠体内连续性传代后传播能力评估及氨基酸位点变化

3．1 材料

3．1．1 毒株

3．1．2 实验动物

3．1．3 主要试剂

3．1．4 主要仪器

3．1．5 引物

3．2 方法

3．2．1 H6N1亚型AIV在豚鼠体内连续传代

3．2．2 在MDCK细胞上繁殖豚鼠鼻洗液中的病毒

3．2．3 评估传代病毒在豚鼠间的传播能力

3．2．4 评价M-275-P18-M2对小鼠的致病力

3．2．5 测定传代病毒的受体结合特性

3．2．6 传代病毒全基因测序

3．3 结果

3．3．1 H6N1亚型AIV在豚鼠体内连续传的结果

3．3．2 用MDCK细胞繁殖的传代病毒的EID50

3．3．3 传代病毒在豚鼠间传播能力评估的结果

3．3．4 M-275-P18-M2对小鼠的致病力

3．3．5 传代病毒的受体结合特性

3．3．6 传代病毒与原代病毒全基因比对结果

3．4 讨论

3．5 本章小结

4 H9N2亚型AIV鼠肺适应株的获得及其氨基酸位点变化

4．1 材料

4．1．1 毒株

4．1．2 实验动物

4．1．3 主要试剂

4．1．4 主要仪器

4．1．5 引物

4．2 方法

4．2．1 H9N2亚型AIV鼠肺适应株的制备

4．2．2 在MDCK细胞上繁殖鼠肺研磨液中的病毒

4．2．3 评价JN-P9-2-M1对小鼠的致病力

4．2．4 评价JN-P9-2-M1在豚鼠间水平传播的能力

4．2．5 测定JN-P5-2-M1和JN-P9-2-M1的受体结合特性

4．2．6 鼠肺适应株全基因测序

4．3 结果

4．3．1 MDCK繁殖的病毒滴度

4．3．2 JN-P9-2-M1对小鼠的致病力

4．3．3 JN-P9-2-M1在豚鼠间传播能力评估的结果

4．3．4 JN-P5-2-M1和JN-P9-2-M1受体结合特性

4．3．5 鼠肺适应毒株与原代病毒全基因比对结果

4．4 讨论

4．5 本章小结

5 H9N2亚型AIV鼠肺适应株JN-P9-2-M1反向遗传操作平台的搭建

5．1 材料

5．1．1 病毒

5．1．2 实验动物和细胞

5．1．3 主要试剂

5．1．4 主要仪器

5．1．5 引物

5．2 方法

5．2．1 扩增JN-P9-2-M1的基因片段并处理

5．2．2 处理PBD载体

5．2．3 构建转染质粒

5．2．4 质粒转染和病毒拯救

5．2．5 拯救病毒的生物学特性

5．3 结果

5．3．1 拯救病毒rJN-P9-2-M1的MLD50

5．3．2 死亡率

5．3．3 MDT

5．3．4 发病率

5．4 讨论

5．5 本章小结

结论

参考文献

读学位期间发表的学术论文

致谢

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