辣椒疫霉效应蛋白PcAvh1与植物互作因子的鉴定和功能分析

摘要

辣椒疫霉(Phytophthora capsici Leonian)是一种重要的植物病原卵菌，常危害茄科、葫芦科、豆科等多种农作物。在与寄主植物的互作过程中，辣椒疫霉分泌大量的效应分子进入植物细胞，激活或者抑制植物的防卫反应，以利于病原物的侵染与定殖。植物为了抵抗病原物的入侵，激活相应的防卫反应。深入研究疫霉与植物互作的机制，对明确疫霉菌致病机理、设计植物疫病控制新策略具有重要的意义。
　　RXLR蛋白是卵菌中一类重要的细胞质效应分子，进入植物细胞内触发或者抑制植物的防卫反应，以利于病原物建立侵染定殖，引致病害的产生。本实验室在前期研究中发现，辣椒疫霉中的一个RXLR效应分子PcAvh1能够触发模式植物本氏烟的细胞死亡(Plant celldeath，PCD);沉默PcAvh1基因导致辣椒疫霉丧失对辣椒和本氏烟的致病力。这些结果表明该效应分子是辣椒疫霉中一个重要的毒性因子，但尚不清楚该效应分子如何参与辣椒疫霉的侵染致病过程。本论文通过鉴定PcAvh1在植物中的互作因子，为认识辣椒疫霉的致病机制提供重要的实验依据。
　　本论文首先利用农杆菌介导的基因瞬时表达技术分析了PcAvh1是否能够引起三生烟、辣椒和番茄的PCD。结果发现，PcAvh1可以在番茄(L402、中杂9号和毛粉802品种)上引起PCD，在辣椒（牛角椒和甜椒品种）上引起严重的黄化现象，但在三生烟上不引起明显的反应。
　　本论文然后通过酵母双杂交技术，以PcAvh1为诱饵蛋白，在辣椒疫霉侵染本氏烟的cDNA文库中筛选与其互作的植物蛋白，获得2个植物蛋白:PP2A-1和PP2A-2（蛋白磷酸酶2A的调节亚基及其同源异构体）。随后，双分子荧光互补分析证明PcAvh1与PP2A之间存在相互作用。
　　接着，本论文利用qRT-PCR技术分析植物蛋白磷酸酶2A编码基因在本氏烟受辣椒疫霉侵染的不同阶段（辣椒疫霉接种本氏烟1.5、3、6、12、24、36、72 h后）以及本氏烟不同组织部位的表达水平。结果发现，PP2A在本氏烟受辣椒疫霉侵染的阶段差异表达;相比于不同的组织部位，PP2A基因在本氏烟的花中高量表达。
　　为了进一步分析植物互作蛋白的功能，本论文利用病毒诱导的基因沉默技术，沉默2个PP2A基因。结果发现，PP2A单基因沉默后本氏烟生长发育正常，而PP2A双基因沉默后本氏烟生长发育受到严重影响，表现出矮小症状;PP2A单基因或者双基因沉默均导致本氏烟对辣椒疫霉侵染的抗性下降。在PP2A沉默的本氏烟植株中表达PcAvh1，发现PP2A的单基因或双基因沉默未影响PcAvh1触发本氏烟的PCD反应。上述结果表明，PP2A在植物抵抗疫霉菌的侵染过程中起着重要的作用。
　　本论文通过酵母双杂交技术获得了与PcAvh1互作的本氏烟蛋白PP2A;利用qRT-PCR明确了PP2A基因在本氏烟面临辣椒疫霉侵染时差异表达，而且在本氏烟不同组织部位的表达水平不一;进一步利用病毒诱导的基因沉默技术分析了PP2A的功能，发现PP2A对于本氏烟抵抗疫霉菌侵染具有重要的作用。本论文的研究结果对认识辣椒疫霉与植物的互作机制提供了重要的实验数据，对设计植物抗疫病策略具有重要的指导价值。

目录

摘要

前言

1 卵菌效应分子

1．1 RXLR效应分子

1．2 RXLR效应分子与植物之间的互作

2 蛋白磷酸酶2A

2．1 结构

2．2 功能

材料与方法

1 供试菌株与植物材料

2 主要质粒载体

3 核酸的提取、合成与纯化

3．1 基因组DNA的提取

3．2 总RNA的提取和cDNA合成

3．3 质粒DNA的提取

3．4 DNA片段的回收纯化

4 载体的构建

5 感受态的制备与转化

5．1 大肠杆菌DH5α

5．2 农杆菌GV3101

5．3 酵母AH109和Y187

6 农杆菌介导的瞬时表达分析

7 酵母双杂交

7．1 诱饵蛋白自激活与毒性分析

7．2 文库筛选

7．3 互作克隆的分析

8 qPCR

9 病毒诱导的基因沉默

10 数据统计分析

结果与分析

1 辣椒疫霉RXLR效应分子PcAvh1引起PCD反应

2 PcAvh1在本氏烟中的互作因子

2．1 酵母菌株

2．2 诱饵蛋白不自激活且不影响酵母生长

2．3 辣椒疫霉侵染本氏烟文库

2．4 酵母文库中的阳性克隆

2．5 本氏烟PP2A与PcAvh1发生互作

3 本氏烟PP2A基因的表达特征

3．1 PP24在辣椒疫霉侵染本氏烟的阶段下调表达

3．2 PP24在本氏烟的花中高量表达

4 本氏烟PP24的功能

4．1 PP2A基因的沉默影响植株的生长发育

4．2 PP2A基因的沉默削弱植物对辣椒疫霉侵染的抗性

讨论

1 辣椒疫霉效应分子PcAvh1激发PCD反应

2 辣椒疫霉效应分子PcAvh1与本氏烟PP2A发生互作

3 PP2A的沉默不影响PcAvh1触发本氏烟的PCD反应

展望

参考文献

附录

攻读学位期间发表的论文

致谢

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