辣椒疫霉效应因子RxLR129113与辣椒互作蛋白的筛选鉴定研究

摘要

辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）引起的辣椒疫病是在世界范围内广泛分布的毁灭性病害之一。辣椒疫霉有20余种寄主，主要侵染叶、果实和茎，引起软腐、倒伏，可减产50%以上，对农业生产、生态造成数百亿元经济损失。辣椒疫霉隶属卵菌门，通过外泌效应因子进入植物质外体或植物细胞破坏防御系统促进病原菌侵染定殖。研究辣椒疫霉效应因子与寄主的互作关系对于探究卵菌致病机制及寄主防卫机制有重要意义。生物信息学分析发现辣椒疫霉分泌357个RxLR类效应分子，目前对于致病疫霉及大豆疫霉的致病机制已初步了解，但对于辣椒疫霉效应因子与寄主的互作机制还缺乏研究。本研究以辣椒疫霉侵染时期上调表达的效应因子PcRxLR129113为研究对象，筛选并鉴定了与PcRxLR129113互作的寄主靶标蛋白，以期解析辣椒疫霉效应因子的致病机制。主要研究内容如下： 1．通过农杆菌瞬时表达体系，对辣椒疫霉效应因子PcRxLR129113进行功能分析及亚细胞定位分析。在本氏烟上农杆菌瞬时表达PcRxLR129113，该效应因子能够抑制由INF1和Bax诱导的植物防卫反应。对PcRxLR129113进行亚细胞定位分析显示，PcRxLR129113定位于植物细胞质及细胞核。 2．使用酵母双杂交（Y2H）筛选PcRxLR129113在辣椒内的靶标蛋白。首先，将公司构建完成的辣椒cDNA质粒文库成功转入酵母菌株Y187中。对酵母文库进行质量鉴定，鉴定结果为：滴度为1.13×106CFU/mL，文库的库容量为1.7×107CFU。其次，成功构建了PcRxLR129113的诱饵载体，对诱饵蛋白进行自激活检测和毒性检测均满足要求。诱饵蛋白PcRxLR129113与辣椒文库杂交后，检测HIS3、URA3、LacZ三个报告基因的表达，对疑似互作子进行测序。经分析验证，筛选出9个互作蛋白，分别为乙醛脱氢酶，亮氨酸拉链类转录因子TGA1，果糖二磷酸醛缩酶，V型质子泵，三磷酸甘油醛脱氢酶，叶绿素a,b结合蛋白，肌动蛋白解聚因子，铁氧还蛋白，应激蛋白。Y2H证明PcRxLR129113与乙醛脱氢酶、亮氨酸拉链类转录因子TGA1与互作。 3．免疫共沉淀（co-IP）证明PcRxLR129113与乙醛脱氢酶互作。将植物表达重组载体PcRxLR129113、ALDH7在本氏烟叶片瞬时共表达48-60h后提取叶片总蛋白进行co-IP，证明PcRxLR129113与乙醛脱氢酶在体内互作。 4．双分子荧光互补（BiFC）证明PcRxLR129113分别与乙醛脱氢酶、亮氨酸拉链类转录因子TGA1互作。农杆菌瞬时表达48-60h，通过共聚焦显微镜成像，证明PcRxLR129113分别与乙醛脱氢酶、亮氨酸拉链类转录因子TGA1互作。 5．RxLRW1-3为PcRxLR129113关键功能域，通过Y2H、BiFC和co-IP证明与ALDH7互作；通过Y2H和BiFC证明RxLRW1-3与TGA1互作。 筛选辣椒疫霉效应因子PcRxLR129113的宿主靶标蛋白，研究靶标蛋白在病菌侵染过程中如何调控植物的防卫反应，为深入探究效应因子PcRxLR129113的致病机制奠定基础，为开发植物广谱抗病性生物农药提供理论依据，为抗病性状改良提供新途径。

目录

声明

英文缩略词及中文对照表

1前言

1.1 植物免疫系统

1.2 病原卵菌效应因子

1.3 疫霉与寄主互作机制研究进展

1.3.1 PsXEG1

1.3.2 Pi04314

1.3.3 Avr3c

1.3.4 Avr3b

1.3.5 AvrRps4

1.4 瞬时表达技术

1.5 蛋白互作研究技术

1.5.1 酵母双杂技术

1.5.2 免疫共沉淀技术

1.5.3 双分子荧光互补技术

1.5.4 pull-down 技术

1.6 研究目的与意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株与植物

2.1.2 载体与感受态

2.1.3 酶、抗体及相关试剂

2.1.4 相关耗材和仪器

2.1.5 常用培养基及有关溶液的配制

2.2 实验方法

2.2.1 RxLR129113生物信息学分析

2.2.2 研究过程中的引物

2.2.3载体构建方法

2.2.4 农杆菌感受态的制备

2.2.5农杆菌转化

2.2.6农杆菌接种本氏烟

2.2.7 PcRxLR129113 亚细胞定位观察

2.2.8 双分子荧光互补

2.2.9 酵母感受态的制备

2.2.10 酵母转化

2.2.11 酵母文库的转化

2.2.12 诱饵载体自激活检测

2.2.13 诱饵载体毒性检测

2.2.14 融合法筛选互作蛋白

2.2.15 酵母质粒的提取

2.2.16 酵母共转化互作验证

2.2.17 蛋白免疫印迹

2.2.18 免疫共沉淀

3 结果与分析

3.1 PcRxLR129113生物信息学分析

3.2 PcRxLR129113在本氏烟功能分析

3.2.1 PcRxLR129113瞬时表达载体构建

3.2.2 PcRxLR129113瞬时表达表型分析

3.2.3 PcRxLR129113亚细胞定位分析

3.3 PcRxLR 129113在辣椒体内互作蛋白的筛选

3.3.1 酵母文库质量鉴定

3.3.2 诱饵载体构建

3.3.3 自激活检测

3.3.4 毒性检测

3.3.5 融合法筛选PcRxLR129113 的互作蛋白

3.3.6 PcRxLR129113与互作蛋白全长共转化互作验证

3.4 BiFC验证RxLR129113与寄主靶标互作

3.4.1 BiFC载体构建

3.4.2 共聚焦成像

3.4.3 Western blot检测PcRxLR129113和ALDH7的蛋白表达水平

3.5 co-IP验证RxLR129113与寄主靶标互作

3.5.1 co-IP载体构建

3.5.2 Western blot检测RxLR129113与ALDH7蛋白表达水平

3.5.3 co-IP验证PcRxLR129113与ALDH7互作

3.5.4 Western blot检测RxLR129113与TGA1蛋白表达水平

3.6 PcRxLR129113截短体RxLRW1-3分别与ALDH7、TGA1的互作验证

3.6.1 Y2H验证PcRxLRW1-3分别与ALDH7、TGA1互作

3.6.2 BiFC验证RxLRW1-3分别与ALDH7、TGA1互作

3.6.3 co-IP验证RxLR W1-3-GFP与ALDH7-FLAG互作

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文