镉对小鼠组织和早期胚胎中DNA甲基化的影响

摘要

随着现代工业的发展，镉污染带来的环境健康问题近年来备受人们的关注，其中镉的组织和生殖毒性及对胚胎发育的影响已成为研究的热点，但镉毒性的分子机理尚不明确。慢性镉中毒是由于长期食用含镉超标的食物，以及长期饮用镉污染的水源而引发的一种全身性的疾病。本研究采用小鼠自由饮用含氯化镉的水(64mg/L)复制动物模型，研究镉对小鼠肝脏、肾脏、卵巢以及早期胚胎基因组DNA甲基化和印迹基因DNA甲基化的影响，从表观遗传的角度探宄镉的毒性。
　　1.镉对组织中DNMTs和MTs的基因表达水平的影响
　　为研究镉对组织中DNA甲基转移酶(DNMTs)基因和金属硫蛋白(MTs)基因表达水平的影响，雌性小鼠连续35d自由饮用氯化镉(64mg/L)水后，应用RT-PCR分析肝脏、肾脏和卵巢中Dnmt1o、Dnmt1s、Dnmt3a、Dnmt3b、MT-Ⅰ、MT-Ⅱ的mRNA水平。结果显示，镉处理能够使得肝脏中Dnmt1 s和Dnmt3b的基因表达水平显著升高(p＜0.05);尽管MTs基因表达水平也升高，但差异不显著。而镉对肾脏和卵巢中DNMTs的基因表达水平没有显著影响;镉对肾脏和卵巢中MTs的基因表达水平也影响较小。结果表明镉对DNMTs和MTs的基因表达水平的影响主要存在与肝脏中;而在肾脏和卵巢中，镉对其没有显著影响。
　　2.镉对小鼠肝脏、肾脏和卵巢中DNA甲基化的影响
　　雌性小鼠连续35d自由饮用含氯化镉的(64mg/L)水复制镉暴露动物模型，采用酶联免疫法(ELISA)和偏重亚硫酸氢盐测序法(BSP)分析肝脏、肾脏和卵巢中基因组DNA甲基化水平以及LINE1、H19和MT基因DNA甲基化水平，探究镉暴露对小鼠组织基因组DNA甲基化及LINE1、H19和MT基因DNA甲基化的影响。结果显示，镉暴露会使组织基因组DNA甲基化水平发生改变，其中肝脏和肾脏DNA甲基化水平较对照组升高，但差异不显著(p＞0.05);而卵巢DNA甲基化水平则发生下降，但差异不显著(p＞0.05)。LINE1和MT的DNA甲基化水平并没有发生显著变化，其中LINE1基因在组织中维持较高水平的DNA甲基化，而MT基因基本没有发生甲基化;镉暴露会使肝脏中H19甲基化水平显著下降(p＜0.05)，对照组和镉处理组分别为39.11％±2.67％和29.74％±3.05％;而在肾脏中镉暴露则会使H19甲基化水平显著上升(p＜0.05)，对照组和镉处理组分别为28.2％±3.23和45.24％±2.98％;镉处理能够上调小鼠卵巢中H19基因甲基化水平，但差异不显著(p＞0.05)，对照组和镉处理组分别为34.67％±3.97％和42.08％±2.37％。结果说明雌鼠连续饮用含镉水35d不会直接影响肝脏、肾脏和卵巢中基因组DNA甲基化水平以及LINE1基因和MT基因的DNA甲基化水平，但对H19的DNA甲基化影响存在位点特异性。
　　3.镉对早期胚胎中DNA甲基化的影响
　　为了解摄入镉对早期胚胎中DNA甲基化的影响，怀孕雌鼠连续2d自由饮用含氯化镉(64mg/L)水后，采用BSP和结合偏重亚硫酸氢盐的限制性酶切分析(COBRA)检测早期胚胎中印迹基因Peg和H19以及逆转座子LINE1的DNA甲基化水平。结果表明，镉处理后，早期胚胎中H19的DNA甲基化水平显著下降到15.44％±1.58％，而对照组为48.97％±1.66％，酶切结果也进一步证实了测序所得的结果;Peg3在对照组和镉处理组均没有发生甲基化，LINE1的DNA甲基化在对照组和镉处理组分别为34.85％±1.79％和39.39％±1.52％，差异不显著(p＞0.05)。结果表明孕鼠摄入镉会直接导致胚胎中父本印迹基因H19的DNA甲基化异常，但并没有对母本印迹基因Peg3和逆转座子LINE1的DNA甲基化产生显著性影响。
　　4.全文结论
　　镉暴露能够影响小鼠早期胚胎中DNA甲基化模式，早期镉暴露能影响小鼠肝脏和肾脏中DNA甲基化模式，但是对卵巢中DNA甲基化模式的影响较小。

目录

摘要

缩略语表

第一篇 文献综述

第一章 DNA甲基化研究进展

1 DNA甲基化的形成机制

2 DNA甲基化在胚胎发育过程中的作用

3 DNA去甲基化机制

4 DNA甲基化抑制基因转录的机制

5 环境因素对DNA甲基化的影响

6 DNA甲基化与癌症

7 结语与展望

第二章 镉中毒研究进展

1 概述

2 镉中毒的研究进展

3 本研究目的和意义

第二篇 试验研究

第一章 镉对组织中DNMTs和MTs的基因表达水平的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第二章 镉对小鼠肝脏、肾脏和卵巢中DNA甲基化的影响

1 材料和方法

2 结果

3．讨论

第三章 镉对早期胚胎中DNA甲基化的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文结论

致谢

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