隔孢伏革菌植酸酶在毕赤酵母中的高效表达研究

摘要

植酸酶作为在饲料添加剂添加于单胃动物饲料中，可提高植物性饲料中磷的利用率和单胃动物对矿质元素的吸收率，并减轻动物粪便中磷对环境的污染，植酸酶的喂养效果已得到了确认，因此具有极高的应用价值，但植酸酶在天然材料中含量太低，难以获得大量产品，价格昂贵;同时酶的热稳定性难以完全满足饲料加工的要求。因此，提高植酸酶基因的表达水平，改善植酸酶的稳定性是一个函待解决的问题。
　　本研究按照毕赤酵母对遗传密码子的偏好性，利用重叠PCR方法人工合成6-phyA，将其插入到pPIC9K载体，构建成6-phyA整合型毕赤酵母表达载体，通过电转化转入GSl15酵母细胞，并筛选出Mut+高拷贝转化子，建立了隔孢伏革菌植酸酶分泌表达量高的毕赤酵母株。主要结果如下:
　　1.根据GenBank隔孢伏革菌植酸酶编码序列成功合成34条引物，并利用重叠延伸PCR技术合成了6-PhyA基因。对合成的植酸酶序列进行了毕赤酵母密码子嗜好性分析，结果较为理想，经软件分析，其翻译为氨基酸序列与野生型100％同源。
　　2.通过对信号肽的选择开展研究，试图通过6-PhyA本身的信号肽与α信号肽相融合，以促进植酸酶的表达，但是效果不理想，通过用酿酒酵母细胞研究6-PhyA野生型信号肽作用，发现在强启动子GPD的驱动下，未发现其能介导6-PhyA在酿酒酵母细胞中的表达，由此证明，野生型信号肽的存在并不能促进植酸酶的表达。
　　3.将植酸酶基因克隆到表达载体pPIC9K中，电击化转入毕赤酵母GSll5，获得重组毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K/L6ph。经甲醇诱导72h后，产酶量达到最高峰，酶活力达到23.7U/mL，实现了植酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达。
　　4.对植酸酶酶学性质的研究表明，SDS-PAGE分析表明表达植酸酶的分子量为50 kD左右。PhyA植酸酶最适温度为37℃，最适pH值为5.5，适合单胃动物的消化道环境;在55℃作用60min后，残余酶活是味保温处理的样品活性的44％，超过55℃保温处理，酶活急剧下降;金属离子对植酸酶的活性没有影响。

目录

摘要

符号说明

第一章 隔孢伏革菌(Peniophora lycii)的植酸酶基因的合成与克隆

1 材料与方法

1．1 引物的设计

1．2 6-磷酸植酸酶(6-PhyA)基因的合成

1．3 6-PhyA毕赤酵母密码子嗜好分析

1．4 PCR产物的克隆

2 结果

2．1 L6ph密码子的毕赤酵母嗜好分析

2．2 pUC57／6-PhyA转化子质粒

3 本章小结

第二章 含野生型信号肽6-PhyA基因在毕赤酵母中的表达研究

1 材料与方法

1．1 毕赤酵母分泌型表达载体的构建

1．2 毕赤酵母细胞的转化

1．3 6ph在毕赤酵母中的表达

1．4 植酸酶的生物学性质的测定

2 结果

2．1 毕赤酵母表达载体pPIC9K／6ph的酶切鉴定

2．2 毕赤酵母转化子的筛选

2．3 6ph在毕赤酵母中表达

2．4 植酸酶活性的检测

3 本章小结

第三章 含野生型信号6ph基因的表达研究

1 材料与方法

1．1 GPD驱动的植酸酶酵母表达载体的构建

1．2 酿酒酵母细胞的转化与鉴定

1．3 植酸酶活性的鉴定

2 结果

2．1 表达载体pGPD-6ph-1的构建

2．2 pGPD-6ph酿酒酵母表达载体的构建

2．3 W303-1A／pGPD-6ph细胞PCR鉴定

2．4 植酸酶的表达鉴定

3 本章小结

第四章 α信号肽引导的6ph基因在毕赤酵母中的表达研究

1 材料与方法

1．1 无野生型信号肽6-磷酸植酸酶基因的PCR扩增

1．2 pPIC9K／L6ph的构建

1．3 pPIC9K／L6ph阳性转化子的鉴定

1．4 高拷贝L6ph毕赤酵母的建立

1．5 毕赤酵母转化子的PCR鉴定

1．6 植酸酶活性的鉴定

2 结果

2．1 pPIC9K／L6ph转化子质粒的酶切鉴定

2．2 GS115毕赤酵母转化子的PCR鉴定

2．3 植酸酶活性的检测

3 本章小结

第五章 植酸酶的酶学性质的研究

1 材料与方法

1．1 时间对酶活性的影响

1．2 植酸酶最适反应温度的研究

1．3 植酸酶最适pH的研究

1．4 植酸酶热稳定性的研究

1．5 金属离子对酶活性影响的测定

2 结果

2．1 培养时间对产酶的影响

2．2 温度对酶活性的影响

2．3 植酸酶的最适pH

2．4 植酸酶的热稳定性

2．5 金属离子对植酸酶的影响

第六章 讨论

1 酵母表达系统

2 外源性基因在酵母细胞中的高效表达

3．植酸酶的酶学性质

4 未来展望

参考文献

综述

攻读学位期间发表的学术论文

声明