副溶血性弧菌耐药性调查及对喹诺酮类药物耐药变异特征的研究

摘要

副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）是非常重要的人兽共患病原菌之一，主要来源于海水及海产品中。该菌常引起腹泻、恶心、发热等典型的胃肠炎型症状，关于其致病机制尚未完全阐明，耐热直接溶血素(TDH)、耐热相关溶血素(TRH)是目前公认的副溶血性弧菌主要毒力因子。近年来，养殖业及临床上抗生素的不规范使用也导致副溶血性弧菌的耐药性日趋严重，对水产养殖业造成了巨大的经济损失，而且国内外缺乏耐药性流行病学连续性监测数据，在耐药机制方面的研究也较少。本研究对107株不同来源的副溶血性弧菌毒力基因分布、耐药性进行了流行病学调查，并通过体外梯度诱导建立耐药株模型，经突变分析研究喹诺酮耐药机制。具体研究方法和结果如下:
　　(1)利用VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定系统对107株分离株完成菌株鉴定，通过PCR扩增进行毒力基因的筛查，其中tlh基因在所有分离株中均有检出，tdh、trh阳性率分别为18.7％(20/107)、8.4％(9/107)，orf8携带率介于两者之间，为15％(16/107)，且orf8+株全部表现为tdh+，且临床分离株的毒力基因阳性率远远高于环境分离株。通过设计引物对107株分离株VPA0166（编码推测外膜蛋白基因）进行PCR检测，发现有55株是a型(996bp)阳性，52株是b型(1050bp)阳性。经测序比对分析发现a型产物中在523至580bp之间有54个碱基缺失，b型序列与已发表基因组序列的副溶血性弧菌RIMD2210633上的相应序列同源性达99％，说明b型菌株在进化过程中与测序菌株更接近。此外，VPA0166多样性与tdh和trh基因的携带具有相关性，全部tdh+菌株属于b型，而trh+菌株均属于a型。
　　(2)药敏试验结果显示，仅有对头孢西丁、四环素和复方新诺明的耐药株检出，对头孢西丁的耐药率为1.9％(2/107)，有一株对四环素和复方新诺明同时完全耐药（基因型为tdh-trh-orf8-），对头孢西丁和环丙沙星的中敏感率较高，分别达94.4％(101/107)、44.9％(48/107)。其中tdh+trh-/tdh-trh+型菌株对环丙沙星的中敏感率(51.7％)比tdh-trh-型菌株(41.9％)占比高约10个百分点，推测在抗生素选择压力下潜在致病性副溶血性弧菌比不带毒菌株有更好耐受能力。此外，统计分析发现在VPA0166a型、b型菌群对环丙沙星中介敏感率分别为23.6％、67.3％，两者差异有统计学意义(P＜0.05)，表明b型菌株对环丙沙星更趋于耐药，在长期抗生素作用下更有可能发展为优势菌群。
　　(3)以耐药性、VPA0166基因型为参考，选择40个分离株利用PCR方法扩增染色体介导的喹诺酮耐药基因，发现parE基因75位的突变与低水平耐药有关，多药外排泵NorM的96位和117位是与环丙沙星耐药机制相关的突变点。此外，对全部分离株进行质粒介导的喹诺酮类耐药基因(PMQR)检测，共检出10株PMQR阳性菌株，阳性率为9.3％(10/107)，其中qnrC、qnrS、qnr VC基因阳性率分别为5.6％(6/107)、0.9％(1/107)、2.8％(3/107)，且都存在碱基突变。通过在环丙沙星梯度培养基中连续传代筛选，建立稳定可靠的耐药株模型，其最低抑菌浓度MIC升高了64～128倍。在对喹诺酮决定区(QRDR)基因和主动外排泵检测中发现gyrB、parE均未发生突变，gyrA基因的第83位点Ser→Ile突变频率最高，广泛存在于高度耐药株中，是作用的主要靶位基因，当环丙沙星MIC为16μg/mL时核苷酸第369位存在ACC→ACA的突变，而对应氨基酸未发生改变。菌株VP1276R存在gyrA基因第83位突变的同时，还在parC基因第85位有Ser→Phe突变。从诱导结果可以看出存在gyrA和parC基因突变的都为VPA0166 b型菌株，推测VPA0166 b型菌株在药物胁迫作用下更容易发生相关耐药基因突变，从而引起耐药性的产生。

目录

摘要

缩略语

第一章 绪论

1 副溶血性弧菌概述

2 副溶血性弧菌毒力因子研究

2．1 溶血毒素

2．2 黏附因子

2．3 侵袭相关因子

2．4 尿素酶

2．5 Ⅲ型分泌系统(TTSS)

2．6 摄铁系统

3 副溶血性弧菌的耐药现状

4 喹诺酮类抗菌药耐药性机制

4．1 靶位基因突变

4．2 质粒介导耐药(PMQR)

4．3 细胞膜通透性改变

4．4 主动药物外排作用

5 药物敏感试验方法

6 论文研究的目的与意义

第二章 副溶血性弧菌毒力基因筛查及编码推测外膜蛋白多样性分析

1 材料与方法

1．1 菌株及来源

1．2 主要试剂

1．3 仪器与设备

1．4 试剂与培养基

1．5 方法

2 结果与分析

2．1 分离株的菌落形态

2．2 菌株鉴定结果

2．3 tlh、tdh、trh和orf8基因的PCR检测结果

2．4 VPA0166基因检测

2．5 VPA0166基因测序结果分析

2．6 VPA0166基因多样性与毒力基因携带关联性分析

3 讨论

第三章 副溶血性弧菌药敏性试验及耐药基因检测

1 材料与方法

1．1 菌株

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器与设备

1．4 主要溶液及培养基的配制

1．5 药敏纸片

1．6 方法

2 结果

2．1 药敏纸片抑菌圈形态

2．2 药敏试验结果

2．3 不同年份和来源菌株对环丙沙星耐药性比较

2．4 VPA0166 a型和b型类群对环丙沙星耐药性分析

2．5 耐药基因检测结果

2．6 部分阳性菌株测序结果分析

3 讨论

第四章 耐药株构建及其基因突变的研究

1 材料

1．1 菌株

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器与设备

1．4 主要溶液及培养基的配制

2 方法

2．1 最低抑菌浓度(MIC)测定

2．2 体外耐药性诱导

2．3 诱导性耐药菌株稳定性实验

2．4 模板DNA提取

2．5 PCR检测

3．1 最低抑菌浓度及耐药性诱导试验结果

3．2 诱导性耐药菌株药敏试验结果

3．3 诱导前后VPA0166基因检测

3．4 诱导性耐药菌株相关基因检测

4 讨论

全文结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

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