RpoN对鼠伤寒沙门菌生物被膜形成的调控作用研究

摘要

沙门菌可感染多种宿主，导致败血症、胃肠炎和腹泻，也可引起人的食物中毒，因此沙门菌病是影响全球公共卫生和经济发展最重要的问题之一。自然环境中，沙门菌以浮游状态和多细胞聚集的菌落如生物被膜状态存在。沙门菌通过附着在生物或非生物的表面形成生物被膜，抵抗消毒剂、环境压力、抗生素和宿主免疫系统的识别，从而促进细菌生存和传播，增强其毒力，与沙门菌病的爆发和患者持续感染相关。为了更好地防控人和动物的沙门菌病，有必要阐明沙门菌生物被膜形成的调控机制。本研究对两株生物被膜形成能力较强的鼠伤寒沙门菌利用Red同源重组系统构建rpoN基因缺失株和回复株，测定其生物被膜形成能力及成分的表达差异，发现RpoN为鼠伤寒沙门菌生物被膜形成相关σ因子之一;运用实时荧光定量PCR的方法测定鼠伤寒沙门菌野生株和rpoN基因缺失株在生物被膜形成过程中下游调控基因的转录水平差异，对转录水平发生明显上调的基因在野生株和rpoN基因缺失株的基础上分别构建缺失株，测定其生物被膜形成能力，进一步确定rpoN基因在鼠伤寒沙门菌生物被膜形成过程中的调控网络。
　　1.鼠伤寒沙门菌rpoN基因缺失株的构建及生物学特性研究
　　对两株生物被膜形成能力较强的鼠伤寒沙门菌利用Red同源重组系统构建rpoN基因缺失株，利用原核表达载体构建回复株;比较野生株、缺失株和回复株的生物被膜形成能力和对环境应激的抵抗力差异，并通过建立的csgA和bcsA基因实时荧光定量PCR方法检测了其生物被膜成分的表达差异。结果显示，与野生株相比，rpoN基因缺失株生物被膜形成能力增强，主要是卷曲菌毛蛋白表达量显著增加引起的。回复株生物被膜形成能力与野生株相似。rpoN基因缺失株在酸性应激和碱性应激条件下对外界环境应激的抵抗力均显著增强，说明rpoN基因为鼠伤寒沙门菌中生物被膜形成相关σ因子之一，这一发现有助于进一步研究沙门菌生物被膜形成的调控机制。
　　2.RpoN在鼠伤寒沙门菌生物被膜形成过程中对下游基因的调控作用
　　以gyrB基因为内参，运用实时荧光定量PCR的方法测定鼠伤寒沙门菌野生株和rpoN基因缺失株在生物被膜形成过程中的下游调控基因csgD、csgA、bcsA、adrA、gcpA、fimA、lpfE、hfq的转录水平差异，发现rpoN基因缺失后，csgD、csgA基因在生物被膜状态下4h、8h和24 h这3个时间段转录水平均呈现极显著增强(P＜0.01)，gcpA、fimA基因在8h转录水平极显著提高(P＜0.01)，lpfE、hfq基因也在8h转录水平有显著增强(P＜0.05)，bcsA、adrA基因转录水平却没有显著变化。在野生株和rpoN基因缺失株的基础上分别构建adrA、gcpA、fimA、lpfE基因缺失株，测定其生物被膜形成能力。结果显示，与野生株相比，adrA基因单缺失株的生物被膜形成能力显著下降(P＜0.05)，而gcpA、fimA、lpfE基因缺失后对其生物被膜形成能力没有明显的影响;与rpoN基因单缺失相比，在其基础上缺失adrA基因得到的双缺失株生物被膜形成能力显著下降(P＜0.05)，缺失gcpA基因得到的双缺失株生物被膜形成能力极显著下降(P＜0.01)，与野生株相似。缺失fimA或lpfE基因得到的双缺失株生物被膜形成能力没有明显的影响。通过实时荧光定量PCR测定两株鼠伤寒沙门菌rpoN基因单缺失株中rpoS基因的表达量以及rpoS基因单缺失株中rpoN基因的表达量，与野生株相比，rpoN基因和rpoS基因的表达量均没有显著差异，即在鼠伤寒沙门菌生物被膜形成过程中σ因子RpoN与RpoS之间没有明显的相关性。因此，rpoN基因可能通过负调控gcpA基因增强鼠伤寒沙门菌生物被膜的形成。

目录

摘要

符号说明

文献综述 沙门菌生物被膜形成的调控机制研究进展

参考文献

第一章 鼠伤寒沙门菌rpoN基因缺失株的构建及生物学特性研究

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 生物被膜的结晶紫染色测定

1．3 生物被膜成分的检测

1．4 rpoN基因缺失株的构建

1．5 实时荧光定量PCR检测csgA基因和bcsA基因的转录差异

1．6 回复株的构建

1．7 生长曲线的测定

1．8 对环境应激抵抗力的测定

2 结果

2．1 基因缺失株的鉴定

2．2 回复株的构建

2．3 生长曲线的测定

2．4 生物被膜形成能力及成分的测定

2．5 qRT-PCR检测csgA基因和bcsA基因的转录差异

2．6 对环境应激抵抗力的检测

3 讨论

参考文献

第二章 RpoN在鼠伤寒沙门菌生物被膜形成过程中对下游基因的调控作用

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 多基因实时荧光定量PCR的检测

1．3 基因缺失株的构建

1．4 生物被膜的结晶紫染色测定

1．5 实时荧光定量PCR检测rpoN基因和rpoS基因的转录差异

2 结果

2．1 多基因实时荧光定量PCR的检测

2．2 基因缺失株的鉴定

2．3 生物被膜形成能力的测定

2．4 实时荧光定量PCR检测rpoN基因和rpoS基因的转录差异

3 讨论

参考文献

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