广州三种淡水鱼冷藏期间菌群变化比较及特定腐败菌特性研究

摘要

淡水鱼因其蛋白质、水分含量高、肌肉pH接近中性,在贮藏、运输、加工处理及销售过程中极易腐败,这主要是因为鲜鱼本身所携带的微生物在鱼死亡后大规模生长,最终造成鱼肉的变质。本文以广州三种淡水鱼样品(鳊鱼、鲫鱼和罗非鱼(即“非洲鲫鱼”))为研究对象,分析淡水鱼在冷藏期间的品质变化,通过高通量测序探讨三种淡水鱼在新鲜点、鲜度终点和腐败点的菌相变化,研究淡水鱼所带低温腐败菌的腐败特性,为淡水鱼更好地防腐保鲜提供依据。主要试验方法和结果如下:
　　1.采集广州地区鲫鱼、鳊鱼和罗非鱼三种鱼样品,通过pH和TVB-N、K值、微生物计数结合QIM分析,阐述了淡水鱼4℃冷藏过程中品质变化,结果表明:淡水鱼冷藏条件下pH和TVB-N、K值、微生物计数和QI分数随贮藏时间的延长显著增加(p＜0.05),其中TVB-N、K值、微生物计数与感观分析呈极显著相关(p＜0.01),pH与感官分析呈显著相关(p＜0.05);从各项指标评估来看,三种淡水鱼中罗非鱼腐败最快,鳊鱼其次,鲫鱼最慢;鲫鱼在前8d保持较好的品质,鳊鱼和罗非鱼在前4d保持较好品质,三种淡水鱼贮藏12d时各指标均呈现腐败;
　　2.对三种淡水鱼新鲜点、鲜度终点和腐败点取样进行高通量测序,通过质量过滤后获得574,357条优质序列,97％置信水平上,所有序列聚类得到24354个OTUs,其中新鲜点菌群比鲜度终点和腐败点菌群多样性更高;分类水平中共测得25个门,64个纲,111个目,379个属。五个主要的门为变形菌门、厚壁菌门、梭杆菌门、放线菌门和拟杆菌门;379个属分属于101个变形菌门,41个厚壁菌门,32个梭杆菌门,15个放线菌门和7个拟杆菌门;淡水鱼新鲜点优势菌属包括Pseudomonas(假单胞菌属)、Cetobacterium(鲸杆菌属)、Chryseobacterium(金黄色菌属)和Akkermansia(阿克曼氏菌);鲜度终点优势菌属包括Pseudomonas(假单胞菌属)、Cetobacterium(鲸杆菌属)和Lactococcus(乳球菌属);腐败点优势菌为Pseudomonas(假单胞菌属)、Carnobacterium(肉食杆菌属)和Lactococcus(乳球菌属);所以,在整个贮藏过程中,Pseudomonas(假单胞菌属)和Akkermansia(阿克曼氏菌)均为优势菌属,但Pseudomonas(假单胞菌属)不断增加,而Akkermansia(阿克曼氏菌)呈现相反趋势,此外,Cetobacterium(鲸杆菌属)、Chryseobacterium(金黄色菌属)和Lactococcus(乳球菌属)随着时间延长比重逐渐增加,Pseudomonas(假单胞菌属)和Akkermansia(阿克曼氏菌)被确定为冷藏淡水鱼的特征腐败菌;
　　3.以广州三种淡水鱼为实验对象,进行筛选腐败菌株。所有的菌落形态都呈现圆形、整体隆起、边缘整齐、表面光滑并且有光泽的特征,大部分菌落呈不透明状态,颜色大致可分为乳白色、白色和黄色。革兰氏染色结果显示分离所得20株耐冷菌株中,G-菌16株,G+菌4株,菌体形状分为杆状、球状、球杆状三种。采用形态观察、生理生化分析和16S rDNA测序鉴定对20株耐冷菌株进行鉴定,结果表明,19株耐冷菌株主要为荧光假单胞菌、假单胞菌属、希瓦氏菌属、嗜冷杆菌。而假单胞菌所占比例最高为90％;
　　4.通过模拟腐败实验来测定三株菌株的pH值、TVB-N值、生长曲线及蛋白浓度、几丁质酶活来进行比较,结果表明:在冷藏过程中TVB-N、生长曲线和几丁质酶活随冷藏时间的延长显著增加,而pH变化不大,蛋白浓度则随冷藏时间的延长而降低。其中在冷藏过程中假单胞菌的TVB-N和几丁质酶活的增加趋势大于另外两株菌株,而生长曲线正好相反;假单胞菌的蛋白浓度的降低趋势大于另外两株菌株。结合感官评价,假单胞菌的腐败能力明显大于另外两株菌株,可确定假单胞菌为优势腐败菌。

目录

摘要

符号缩写

第一章 绪论

1．1 淡水鱼现状

1．2．1 淡水鱼的腐败

1．2．2 水产品特定腐败菌

1．3 鱼类品质评价指标研究进展

1．3．1 感官评价

1．3．2 化学指标

1．3．3 物理指标

1．3．4 微生物指标

1．4 鱼类微生物菌群的研究方法

1．4．1 稀释涂布平板法

1．4．2 16S rDNA序列分析

1．4．3 Rep-PCR扩增技术

1．4．4 高通量测序

1．5 腐败菌腐败能力研究

1．6．1 研究目的与意义

1．6．2 主要研究内容

第二章 广州淡水鱼低温储藏期间品质变化的研究

2．1．1 样品

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 主要试剂与培养基的配制

2．2 试验方法

2．2．1 样品的采集

2．2．2 pH值的测定

2．2．3 挥发性盐基氮的测定

2．2．4 K值的测定

2．2．5 菌落总数的测定

2．2．6 感官评定

2．2．7 数据分析

2．3 结果与分析

2．3．1 淡水鱼冷藏过程中pH值变化

2．3．2 淡水鱼冷藏过程中TVB-N值变化

2．3．3 淡水鱼冷藏过程中菌落总数变化

2．3．4 淡水鱼冷藏过程中K值变化

2．3．5 淡水鱼冷藏过程中感观指数变化

2．3．6 淡水鱼感官评价指标与其他相应指标的相关性分析

2．3．7 三种淡水鱼鲜度终点和腐败点的制定

2．4 本章小结

第三章 应用高通量测序方法研究淡水鱼冷藏期间菌群变化

3．1 材料

3．1．1 主要试剂

3．1．3 常用试剂的配制

3．2 试验方法

3．2．1 广州三种淡水鱼各点DNA的提取

3．2．2 淡水鱼微生物16S rDNA V3区扩增

3．2．3 PCR产物纯化与定量

3．2．4 统计学处理

3．3 结果与分析

3．3．1 广州三种淡水鱼基因组DNA的扩增产物

3．3．2 淡水鱼冷藏过程中微生物物种序列数目

3．3．3 微生物物种操作分类单元

3．3．4 淡水鱼冷藏过程中微生物物种稀疏曲线及丰度分布

3．3．5 微生物物种Alpha多样性

3．3．6 微生物物种丰度及其差异性

3．3．7 淡水鱼冷藏过程中微生物物种主坐标分析

3．3．8 热点图

3．4 讨论

3．5 本章小结

第四章 广州淡水鱼中优势耐冷菌的分离筛选和鉴定

4．1．1 原料

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器

4．1．4 主要培养基

4．1．5 分子鉴定试验相关试剂

4．2 试验步骤及流程

4．2．1 样品的处理及耐冷细菌的分离纯化

4．2．2 革兰氏染色步骤

4．2．3 生理生化试验步骤

4．2．4 细菌基因组DNA的提取

4．2．5 耐冷细菌的16S rDNA测序鉴定

4．2．6 16S rDNA V3区扩增

4．2．7 扩增产物的检测

4．3．1 耐冷菌候选株菌落形态

4．3．2 生理生化结果

4．3．3 耐冷菌的16S rDNA测序鉴定

4．3．4 16S rDNA鉴定结果

4．4本章小结

第五章 优势耐冷腐败菌腐败能力分析与鉴定

5．1．1 样品

5．1．2 主要试剂

5．1．3 主要仪器

5．1．4 主要试剂与培养基的配制

5．2 试验方法

5．2．1 构建鱼肉腐败模型

5．2．2 感官评定

5．2．3 pH值的测定

5．2．4 挥发性盐基氮的测定

5．2．5 耐冷菌生长曲线的测定

5．2．6 蛋白酶活测定

5．2．6 几丁质酶活测定

5．3 结果与分析

5．3．1 冷藏过程中菌株感官指数的变化

5．3．2 冷藏过程中菌株pH值和TVB-N值的变化

5．3．3 冷藏过程中菌株生长曲线的变化

5．3．4 冷藏过程中菌株蛋白酶活的变化

5．3．5 冷藏过程中菌株几丁质酶活的变化

5．4 讨论

5．5 本章小结

全文结论

参考文献

致谢

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