斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF50基因的研究

摘要

斜纹夜蛾属鳞翅目夜蛾科,是严重危害包括水稻、玉米、棉花等共计109科389种农作物的害虫。现发现并鉴定出一种全新的以斜纹夜蛾为特异性宿主的杆状病毒种,命名为斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ(SpltNPVⅡ),其繁殖率和毒性极强,杀虫时间短,而且BV在虫体内的增值速率最快,具有作为生物杀虫剂所具有的优良特性和潜力。斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ(SpltNPVⅡ)中的146个开读框(OpenReading Frame,ORF)中,ORF50最为特殊,在国内外均未见研究报道,是新型未知基因。NCBI在线BLAST比对未发现与与ORF50有相似度的基因。将ORF50编码蛋白序列在NCBI数据库中进行在线BLAST比对结果显示,ORF50的编码蛋白序列没有保守序列,目前还没有任何与之相似度大于30％的蛋白序列。
　　 本研究通过蛋白质谱分析SpltNPVⅡ的包埋型病毒(ODV)和芽生型病毒(BV)组成蛋白差异,结果中均可检测到ORF5O的编码蛋白gp50的存在,而且相比较在BVs组成型蛋白中的gp50存在检测分值要比ODV中高,因为SpltNPVⅡ的BV在虫体内的增值速率最快,推测gp50可能与BV在虫体内对周围细胞的感染有着重要作用。以pGL3-Basic对ORF50的前导序列50P进行启动子活性分析,在未加诱导因子的情况下,重组载体能够顺利表达萤光素酶,在荧光底物的存在下,能够产生荧光,而且其光量子强度均值达到18456,与阴性对照217差异极大,由此可以确定50P启动子为SpltNPVⅡ的早期启动子。分别合成各感染时相cDNA,以引物50P1:5’ttgaaagacgacggtgtgt3’,50P2:5'ctattcgacatgagcaacaatctg3’,25μL反应体系进行RT-PCR检测,结果显示,ORF50在2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h均有转录。根据目的基因序列设计引物,50P3:5'-gtcgatgaagaggtctggcaatac-3’；50P4:5'-ctcttcgttcataatcatgtcgtgc-3’,以提取RNA稀释到等量作为本底参照,进行荧光定量PCR分析,结果与RT-PCR一致。以等量的各个时期的总蛋白为抗原,豚鼠面议纯化蛋白为一抗,羊抗豚鼠抗原为二抗,进行蛋白免疫印迹(western blotting)检测表达时相分析,结果发现2 h、4 h、12 h、24 h、36 h、48 h等时相总蛋白中均能够检测到ORF50编码蛋白gp50的存在。结合RT-PCR,荧光定量PCR、蛋白免疫印迹(western blotting)检测表达时相分析,均能够确定ORF50在病毒感染2-h后开始转录表达,进一步表明该基因是一个早期基因。有关研究为深入分析SpltNPVⅡ的ORF50功能奠定了基础。