低剂量辐射及CD44单克隆抗体IM7对慢性髓细胞白血病干祖细胞辐射敏感性及归巢影响的实验研究

摘要

目的和意义
　　 现有的研究结果表明，白血病干细胞（Leukemic stem cells，LSCs）是白血病发生、维持的基础，其95％以上的细胞处于G0期，对常规的放、化疗多不敏感，成为白血病治疗后残留与复发的根源，因此白血病干细胞的根除是治疗成功的关键。
　　 目前针对LSCs的靶向治疗很多，但单一治疗效果不太理想，因此有必要从多途径、多种治疗手段联合应用方面深入研究与探讨，以提高靶向治疗的疗效。近年来，有研究证实白血病干细胞必须归巢及植入骨髓才能发挥其生物学特性。因此，人们就试图通过特异性干扰LSCs细胞的归巢、植入，从而改变LSCs的命运。其中，细胞表面黏附分子CD44与多种恶性肿瘤发生、转化相关，因此受到研究者的关注。Krause等研究证实了表达BCR-ABL融合基因的LSCs归巢和植入骨髓需要CD44分子的参与。
　　 LSCs细胞多处于休眠期，对常规照射剂量抗拒，非常规照射剂量成为研究热点。低剂量照射（Low dose irradiation，LDR）因其具有免疫增强效应、超敏感性、抗肿瘤效应等倍受关注。但LDR的超敏感性，能否有效地杀灭化疗后残存的LSCs细胞；其免疫增强效应能否有效地放大GVL效应以清除LSCs细胞等，目前未见报道。
　　 基于上述的研究现状以及我们的设想与推测，本实验以表达BCR-ABL融合基因的LSCs细胞归巢和植入过程需要CD44分子的参与，以及LDR的免疫增强效应、超敏感性及抗肿瘤作用为切入点，研究抗CD44单克隆抗体LDR、IM7单独或联合对人CML-LSCs细胞辐射敏感性及归巢的影响。研究目的在于为靶向治疗人CML 干祖细胞提供新的治疗策略与思路，并拓宽放射治疗技术在白血病治疗中的应用。
　　
　　
　　 方法
　　 第一部分 取20例健康产妇脐血100ml，免疫磁珠法分离纯化脐血CD34+干祖细胞作为对照组；取40例初诊慢性髓细胞白血病慢性期患者骨髓液5-10ml，免疫磁珠法分离纯化白血病CD34+干祖细胞作为实验组，克隆形成分析法测定两种细胞的存活分数，采用多靶单击模型和线性二次模型拟合细胞存活曲线，根据D0、Dq及α／β比值等放射生物学参数，比较两种细胞的放射敏感性。流式细胞仪检测两种细胞周期时相分布的差异性。
　　 第二部分 将上述两种免疫磁珠法分离纯化的CD34+细胞依据LDR剂量0cGy、12.5 cGy和50cGy分组，辐照后分别于24、48和72h收集细胞，流式细胞仪检测LDR对两种干祖细胞的细胞周期分布及凋亡率的影响；另于辐照后24h收集细胞应用Western Blotting检测CML-CD34+细胞P53蛋白的表达变化；RT-PCR、RQ-PCR检测两种细胞中P16、DAPK1基因mRNA表达的变化。
　　 第三部分 将上述两种免疫磁珠法分离纯化的CD34+细胞与CD44单克隆抗体IM7孵育后，首先应用流式细胞仪检测CML-CD34+细胞和脐血CD34+细胞CD44分子表达情况，再利用MTT法检测IM7孵育前后两种干祖细胞与血管内皮细胞黏附能力的变化，Transwell实验检测其迁移能力的改变。
　　 第四部分 取20例初诊的慢性髓细胞白血病慢性期患者的CML-CD34+细胞，利用Annexin-V试剂盒检测CD44单克隆抗体IM7对CML-CD34+细胞凋亡的影响；RQ-PCR及RT-PCR检测CML-LSCs中原癌基因C-myc、NF-κB表达状况；Western-blot检测IM7孵育后CML-CD34+细胞中Bcl-2蛋白表达的变化。
　　 结 果
　　 第一部分 (1)脐血CD34+细胞和CML-CD34+细胞对射线均较敏感，呈现良好的剂量效应关系；（2）多靶单击模型中，脐血CD34+细胞的SF2、D0、Dq值分别为0.3508、2.247、0.083，CML-CD34+细胞的 SF2、D0、Dq值分别为0.2972、1.828、0.037；（3）线性二次模型中，脐血CD34+细胞和CML-CD34+细胞的α／β值分别为4.577和7.879。（4）脐血CD34+细胞89.9％处于G0/G1期，而CML-CD34+有50％的细胞处于G0/G1,44.5％的细胞处于DNA合成的S期，5.4％细胞分布于G2/M期，两种细胞的周期分布总体差异有显著性（P<0.05）。
　　 第二部分 (1）CML-CD34+细胞经12.5cGy剂量处理后48h出现G0∕G1期阻滞，该剂量点72h出现G2/M期阻滞，50cGy剂量点照射后72h出现了G0∕G1期阻滞现象。（（2）CML-CD34+细胞经LDR处理后，早期凋亡率随时间推移逐渐增加，50cGy剂量照射后72h处达到(17.75±11.76)％，与未照射组(6.13±4.71）％相比差异有统计学意义（P＜0.05）。（3）CML-CD34+细胞经12.5cGy剂量照射后P16 mRNA表达略上调，50cGy剂量照射后 P16 mRNA水平明显增高（P＜0.01）。（4）LDR各剂量点照射后24h时，CML-CD34+细胞中P53蛋白的表达无明显的变化，与对照组及各组间相比差异均无统计学意义(P>0.05)。（5）CML-CD34+细胞经辐照后DAPK1基因表达均上调（P＜0.01），以50cGy剂量点处上调最为显著。（6）脐血CD34+细胞经LDR各剂量点辐照后细胞周期分布、早凋亡率及凋亡相关基因、蛋白（P53蛋白、P16mRNA、DAPK1mRNA）均无明显的变化(P>0.05)。
　　 第三部分 IM7对CML-CD34+细胞表面CD44 粘附分子阳性识别率高达（86.6±2.10）％，荧光强度为（9.72±1.02），而脐血CD34+细胞CD44 阳性识别率仅为（25.4±1.70）％，荧光强度为（5.34±0.96），两组之间差异有统计学意义（(P<0.05)。（2）CML-CD34+细胞经IM7孵育后，与血管内皮细胞的黏附能力显著下降（570nm，OD值为0.34±0.07，对照组为 0.62±0.11，P<0.05）。（3）经IM7孵育后CML-CD34+细胞的跨内皮迁移能力明显受到抑制，抑制率为46％-63％。（4）IM7孵育前后，脐血CD34+细胞与骨髓基质细胞的粘附能力及跨内皮迁移能力均无明显变化(P>0.05)。
　　 第四部分 经IM7孵育后，CML-CD34+细胞的早期凋亡率（﹪）为12.58±2.84，与对照组（5.42±1.84）相比差异有统计学意义（P＜0.05）；CML-CD34+细胞原癌基因C-mycmRNA、NF-κB mRNA表达水平明显降低，Bcl-2蛋白表达量下降了65％，同时NF-κB激活-核转运活性明显受到抑制。
　　 结 论
　　 （1）CML-CD34+细胞及脐血CD34+细胞照射后亚致死损伤修复能力均较差，对射线均较敏感，但CML-CD34+细胞对射线的敏感性是脐血CD34+细胞的1.23倍，可能与两者之间细胞周期时相分布有关。
　　 （2）LDR可特异性诱导CML-CD34+细胞辐射兴奋效应，刺激细胞周期的再分布，增加辐射敏感性，DNA辐射损伤通过非p53依赖途径诱导激活p16基因、DAPK1基因，从而促进CML-CD34+细胞凋亡
　　 （3）CD44单抗IM7在体外能有效抑制CML-CD34+细胞的粘附和迁移，从而为白血病的靶向治疗提供新的治疗靶点与理论依据。
　　 （4）CD44单抗IM7能有效诱导CML-CD34+细胞凋亡，可能机制为IM7与细胞膜上CD44粘附分子受体结合后启动一系列异常信号通路，抑制了核转录因子NF-κB的活性，C-myc及Bcl-2作为NF-κB下游效应靶基因表达下调，从而诱导CML-CD34+细胞的凋亡。
　　 综上所述：本研究表明（1）CML-CD34+细胞及脐血CD34+细胞对射线均较敏感，但两者之间的辐射敏感性的差异，可能与其细胞周期时相分布有关；（2）低剂量辐射可特异性引发CML-CD34+细胞的辐射兴奋效应，DNA辐射损伤通过非p53依赖途径诱导激活p16基因、DAPK1基因，从而促进CML-CD34+细胞凋亡；（3）抗CD44单抗IM7在体外不仅能有效抑制CML-CD34+细胞的粘附和迁移，而且还可以诱导CML-CD34+细胞凋亡。研究结果提示LDR能特异性诱导白血病干祖细胞的辐射兴奋效应、超敏感性，具有一定的抗肿瘤效应，该技术有一定的临床应用价值与潜力；IM7对白血病干祖细胞归巢与粘附能力的影响，可为白血病干细胞靶向治疗富集新的治疗策略与思路。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词表

引 言

第一部分 CML与脐血的CD34+细胞辐射敏感性的实验研究

第二部分 LDR对慢性髓细胞白血病CD34+细胞辐射敏感性的影响及相关机制的实验研究

第三部分 CD44单抗IM7对CML-CD34+细胞粘附与迁移能力影响的体外研究

第四部分 抗CD44单抗IM7对CML-CD34+细胞凋亡影响的研究

结 论

综述：白血病干细胞研究现状

攻读学位期间公开发表的论文

致 谢