草鱼出血病病毒vp6核酸疫苗和亚单位疫苗的免疫效果研究

摘要

草鱼出血病病毒(Grass carp reovirus，GCRV)是水生呼肠孤病毒属中致病力最强双链RNA(dsRNA)病毒，因曾引起中国西南的85％草鱼幼鱼发生草鱼出血病而被首次发现。目前的疫苗包括灭活疫苗和减毒疫苗，灭活疫苗不能进入主要组织相容性复合体I(MHCI)类抗原呈递途径，不能有效的诱导细胞毒性T细胞(CTL)反应，因此，免疫效果相对不理想、免疫力持久性差；减毒疫苗生产成本高，有毒力返祖现象，安全性较差，有回复致病性的潜在危险。鱼体免疫接种的常规方法是浸泡免疫和注射免疫，浸泡免疫方法操作简单，但需要大量的疫苗；但注射免疫要求鱼体要有一定的规格，操作强度大、技术要求高、技术推广困难，而且鱼的捕捞过程及注射对鱼体均造成较大损伤。因此，生产上急需开发安全可靠、高效多价、使用简便的草鱼出血病口服亚单位/DNA联合疫苗。
　　 1.草鱼出血病病毒vp6核酸疫苗的免疫效果评估
　　 为了评估草鱼出血病病毒(GCRV) vp6基因核酸疫苗的免疫效果，将vp6基因克隆进pFastBacTMDual载体杆状病毒多角体蛋白(Polh)启动子下游，同时将团头鲂（Megalobrama amblycephala）的β-肌动蛋白启动子控制的vp6基因克隆进杆状病毒P10启动子下游获核酸疫苗载体pFastBac-FA-VP6-ph-VP6。按每尾分别注射疫苗载体10、30、60μg免疫草鱼（体长14～20 cm，体重60～120 g），同设pFastBacTMDual载体(30μg/尾)阴性对照组及空白对照组(0.4 ml/尾无菌水)。于免疫后不同时间通过RT-PCR检测免疫鱼体中vp6基因的表达，并于免疫后第14、21、28、49、70 d分别通过间接凝集反应检测血液中的抗体水平和在免疫第21 d感染GCRV评估免疫保护效果。结果显示，核酸疫苗免疫草鱼后，各免疫组均有抗体产生，抗体效价在免疫后第28 d达到最高;攻毒后每尾注射疫苗载体10、30、60μg组的死亡率分别为0％、0％、5％， pFastBacTMDual载体对照组和空白对照组分别为30％和100％。表明构建的核酸疫苗对草鱼病毒性出血病有较好的免疫保护效果。
　　 2.原核表达GCRV VP6蛋白对草鱼出血病的免疫保护作用
　　 为了探讨草鱼出血病病毒(GCRV)VP6亚单位疫苗对草鱼出血病的免疫保护作用，将vp6基因克隆进原核表达载体pET-28a(+)，构建了重组质粒pET28a(+)-VP6。SDS-PAGE和Western blotting显示，重组VP6蛋白的分子量约为43 kDa，主要以包涵体形式存在，重组蛋白占菌体总蛋白的20％左右；Ni2+柱纯化后的重组蛋白，以每尾500μg肌肉注射免疫草鱼(14～20 cm，60～120 g)，并在第14、21、28、49、70 d通过间接凝集反应检测抗体水平，结果显示，免疫注射后第14d可检测到鱼体产生的特异性抗体，第21d达到最高峰，第70 d仍可检测到抗体的存在；免疫注射第21 d人工接种GCRV，免疫后的草鱼对出血病的保护力达100％。研究结果为草鱼出血病亚单位疫苗的研发奠定了基础。
　　 3.GCRV VP6蛋白亚单位/DNA联合口服疫苗及免疫效果评价
　　 杆状病毒具有高效表达外源基因以及安全有效向脊椎动物细胞传递基因的功能，为了研发安全可靠、高效多价、使用方便的VP6蛋白亚单位/DNA联合口服疫苗，本研究分别用团头鲂的β-actin启动子和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的多角体蛋白启动子控制GCRV vp6基因构建供体质spFastBac-FA-VP6-ph-VP6，通过Bac to Bac系统获重组杆状病毒BacFish-VP6。重组病毒感染5龄家蚕后，采集血液，SDS-PAGE和Western blotting显示，重组VP6蛋白的分子量约为53 kDa。重组病毒感染蚕蛹120h后，VP6蛋白的表达水平达到最高值，达血淋巴总蛋白的5％左右，冷冻干燥制成冻干粉，然后分别以1％、5％、10％的比例掺入饲料中（含2.5％淀粉），口服免疫草鱼，通过间接凝集反应检测抗体水平，结果显示，抗体产生水平呈剂量依赖的方式，并在免疫后第3～4周抗体水平达到最高，至3个月后仍能检测到特异性抗体的存在；RT-PCR检测结果显示，在口服免疫的鱼血液中可特异性地检测到vp6基因的mRNA，免疫组化法在免疫鱼的肝、肾组织中可检测到VP6蛋白，表明用感染重组杆状病毒BacFish-vp6的蚕蛹冻干粉口服免疫，重组杆状病毒BacFish-vp6能进入鱼体，并正确表达VP6蛋白，刺激鱼体产生免疫反应。初步的研究结果表明，表达VP6蛋白的蚕蛹冻干粉具有蛋白亚单位/DNA疫苗的双重功效，口服免疫能诱导鱼产生特异性免疫反应。

目录

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第一章 文献综述

1 草鱼出血病病毒研究进展

1．1 草鱼出血病的症状及流行规律

1．2 GCRV形态特征

1．3 GCRV理化特性

1．4 病毒组织嗜性和病理变化

1．5 GCRV分子生物学

1．6 GCRV的免疫学效应

1．7 草鱼出血病免疫防治研究

2 家蚕杆状病毒及其表达系统

2．1 家蚕Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的构建

2．2 家蚕杆状病毒表达系统的优点

2．3 家蚕杆状病毒表达系统存在的缺陷

2．4 利用杆状病毒作为表达载体的疫苗研究

参考文献

第二章 研究目的和研究内容

1 研究的目的和意义

2 研究的主要内容

2．1 草鱼出血病病毒(GCRV)vp6核酸疫苗的构建及免疫效果评估

2．2 GCRVVP6蛋白对草鱼出血病的免疫效果评估

2．3 GCRV VP6蛋白亚单位／DNA联合口服疫苗的制备及免疫效果评估

3 技术路线

第三章 实验一般材料与方法

1 实验材料

1．1 载体与菌种

1．2 生物材料

1．3 工具酶及试剂盒

1．4 其它试剂

1．5 主要实验试剂与配制

1．6 免疫组化相关试剂

1．7 间接凝集法测抗体效价相关试剂

2 常用仪器

3 试验方法

3．1 TG1感受态细胞的制备

3．2 DNA的连接反应体系

3．3 连接产物的转化

3．4 碱裂解法少量制备质粒DNA

3．5 DNA的酶切反应体系

3．6 PCR扩增目的片段

3．7 琼脂糖凝胶电泳

3．8 目的片段的分离和回收

3．9 Bac to Bac系统

3．10 SDS-PAGE蛋白质电泳

3．11 Western blotting

3．12 多克隆抗体的制备

3．13 过柱纯化蛋白

3．14 过柱纯化蛋白含量测定(Bradford蛋白质测定法)

3．15 免疫组化

3．16间接凝集法测抗体效价

参考文献

第四章 草鱼出血病病毒vp6核酸疫苗的免疫效果评估

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 GCRV vp6基因的序列分析

2．2 核酸疫苗载体pFastBac-FA-VP6-ph-VP6的鉴定

2．3 免疫后鱼体中vp6基因的表达

2．4 核酸疫苗免疫鱼后抗体效价检测

2．5 核酸疫苗对草鱼出血病的免疫保护作用

3 讨论

参考文献

第五章 草鱼出血病病毒VP6蛋白的原核表达、纯化及免疫效果研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 材料方法

2 结果与分析

2．1 表达载体pET28a(+)-VP6的鉴定

2．2 重组VP6蛋白的鉴定

2．3 诱导表达时间的优化

2．4 VP6重组蛋白的可溶性分析

2．5 重组VP6蛋白的纯化

2．6 重组VP6蛋白的免疫效果

3 讨论

参考文献

第六章 GCRV VP6蛋白亚单位／DNA联合口服疫苗的制备及免疫效果评价

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 重组病毒BacFish-VP6的产生及鉴定

2．2 病毒滴度的测定

2．3 VP6抗体的鉴定

2．4 重组VP6蛋白在细胞和五龄家蚕中的表达

2．5 口服免疫鱼体中vp6特异性抗体的产生规律

2．6 口服免疫后鱼血中vp6 mRNA的检测

2．7 免疫荧光检测免疫草鱼组织和BacFish-VP6感染CIK细胞中的VP6蛋白

3 讨论

参考文献

结论

1 已取得的成果

2 有待进行的研究

攻读硕士学位期间发表的学术论文

1 研究论文

2 GenBank登录序列

论文说明

附录

1 缩略词表

2 部分质粒图谱

致谢