探讨内皮祖细胞大自噬和分子伴侣介导自噬相互作用的实验研究

摘要

目的:体外诱导分化内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，然后应用大自噬激活剂雷帕霉素、大自噬抑制剂3-MA（3-甲基腺嘌呤）干预，探讨干预后的EPCs中大自噬和分子伴侣介导的自噬生物学特性的变化，为下肢深静脉血栓等疾病的治疗提供一种新的思路和实验依据。
　　方法:1.Ficoll密度梯度离心法获取SD大鼠的骨髓单个核细胞(bone marrow-derived mononuclear cells，BMMNCs)，内皮祖细胞培养基(EGM-2MV)体外诱导分化为EPCs并进行鉴定。观察细胞形态学、增殖活性、内皮细胞系列标志VEGFR-2、vwF免疫组化，祖细胞标志CD133、CD34免疫荧光技术动态鉴定。利用三维培养实验鉴定EPC是否具有形成血管功能。
　　2.将贴壁EPCs细胞随机分成2组，一组为雷帕霉素组，包括对照组（正常培养组）及雷帕霉素六个浓度组1μg/L、2.5μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、40μg/L的EGM-2MV培养基中。另一组为3-MA组，包括对照组及3-甲基腺嘌呤（3-methlyadenine 3-MA）六个浓度组，分别为1.25mmol/l、2.5mmol/l、5mmol/l、10mmol/l、20mmol/l、40mmol/l。各组分别培养24h。2.1、采用常规四氮唑蓝(methylthiazol yltetrazolium MTT)比色法测定各浓度3-MA组、雷帕霉素组及对照组对EPCs增殖的作用。2.2、利用Western blot检测LC3-Ⅱ、LAMP2A蛋白表达的变化。2.3、利用免疫荧光方法分析LAMP2A蛋白荧光强度变化。
　　结果:1.新分离的骨髓单个核细胞(BMMNCs)呈圆形，大小不一，第3天左右大部分细胞开始贴壁，形态有梭形、三角形、纺锤形或不规则形，第5-8天左右出现细胞集落和细胞线状排列，第8-12天接近融合，呈典型鹅卵石样外观。细胞生长曲线呈，“S”形，EPCs在培养的6～11天增殖较快，11天后进入平台期，生长曲线呈典型“s”形外观。贴壁细胞的CD34、VEGFR、vWF、CD133均表达阳性。早期EPCs细胞增殖明显，但未形成管腔样结构。晚期EPCs增殖明显，形成网状连接的管腔样结构。
　　2.经雷帕霉素作用后测定的OD值呈明显降低的趋势，对照组明显高于干预组(P＜0.05)。3-MA1.25mmol/l，2.5mmol/l对于EPCs作用24及48小时后细胞增殖和对照组相比无明显影响，5mmol/l对于EPCs的增殖有明显的促进作用，10mmol/l，20mmol/l，40mmol/l3-MA和对照组相比明显抑制EPCs增殖(P＜0.05)。
　　Western blot检测各组目的蛋白表达情况，发现雷帕霉素组LC3-Ⅱ蛋白在1-5ug/l范围内表达明显升高的趋势，干预组明显高于对照组(P＜0.05)，在10-40ug/l范围内LC3-Ⅱ蛋白随着给药浓度的增加呈逐渐递减表达，其中10ug/l、20ug/l给药组高于对照组(P＜0.05)，40ug/l给药组低于对照组(P＜0.05)。LMAP2A蛋白表达随着给药浓度的增加呈逐渐递减表达，干预组蛋白表达明显低于对照组(P＜0.05)。3MA组作用EPCs24小时后LAMP2A蛋白在1-10mmol/l范围内随着给药浓度的增加呈逐渐递增表达，干预组蛋白表达明显高于对照组(P＜0.01)，在20-40mmol/l范围内LAMP2A蛋白随着给药浓度的增加呈逐渐递减表达，干预组蛋白表达高于对照组(P＜0.01)。LC3-Ⅱ蛋白表达随着给药浓度的增加呈逐渐递减表达，干预组蛋白表达明显低于对照组(P＜0.05)。
　　免疫荧光检测发现雷帕霉素组LAMP2A表达的平均光密度值跟对照组相比呈逐渐下降趋势(P＜0.05)。3MA组LAMP2A表达的平均光密度值在1.25-10mmol/l范围内跟对照组相比呈逐渐上升趋势，在10-40mmol/l范围内呈现逐渐下降趋势，但跟对照组相比无显著意义(P＞0.05)。
　　结论:说明内皮祖细胞的大自噬和分子伴侣介导自噬之间存在一定的功能互补的作用关系。

目录

声明

摘要

引言

参考文献

第一部分 大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养和鉴定

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

实验结果

第二部分 探讨内皮祖细胞大自噬和分子伴侣介导自噬相互作用的实验研究

一、MTT法检测3-甲基腺嘌呤(3-MA)、雷帕霉素对内皮祖细胞增殖的抑制作用

材料与方法

实验结果

二、Western blot检测雷帕霉素、3MA给药后EPCs内LC3-Ⅱ、LAMP2A蛋白表达的变化

材料与方法

实验结果

三、免疫荧光检测雷帕霉素、3MA给药后EPCs内LAMP2A表达的变化

材料与方法

实验结果

讨论

一、内皮祖细胞

二 自噬

结论

参考文献

综述：分子伴侣介导的细胞自噬作用机制及其功能

中英文缩略词表

攻读学位期间公开发表的论文

致谢