Ad-IL-24-OSM双基因腺病毒载体的构建及其对人黑色素瘤细胞生长抑制作用的体内外实验研究

摘要

目的:
　　 构建携带白细胞介素24（Interleukin-24，IL-24）基因和抑瘤素M(OSM)基因的双基因共表达腺病毒载体（Ad-IL-24-OSM）并开展对A375人黑色素瘤细胞体内外抗肿瘤效应的实验研究。
　　 方法:
　　 在本科室已成功构建pTrack-CMV-poly-A-promoter转移质粒的基础上，在多克隆酶切位点的BglⅡ、SalⅠ之间和NotⅠ、XhoⅠ之间分别插入IL-24和OSM基因片段，构建pAdTrack-CMV-IL-24-polyA-promoter-OSM重组转移载体，经同源重组、包装和扩增获得Ad-IL-24-OSM双基因共表达重组腺病毒子，体外检测Ad-IL-24-OSM重组腺病毒子的效价，感染A375黑色素瘤细胞后，RT-PCR、westernblot法检测IL-24、OSM在A375人黑色素瘤细胞中的转录和表达;荧光显微镜观察感染后的A375细胞的形态学改变;MTT法检测Ad-IL-24-OSM对A375黑色素瘤细胞的生长抑制作用;流式细胞术(FCM)检测重组病毒子对A375黑色素瘤细胞的周期生长抑制和促凋亡效应;半定量RT-PCR法检测A375黑色素瘤细胞中的p21、p53、Bax、Bcl-2mRNA的表达水平。westernblot检测Caspase-3凋亡相关蛋白的表达;通过建立A375人黑色素瘤细胞移植瘤瘤动物模型，用Ad-IL-24-OSM重组病毒子进行实验干预，检测瘤体重量，HE染色法检测瘤块组织切片中的细胞核形态的变化;免疫组化检测移植瘤块切片中P21、P53、bax、bcl-2、CD34、COX2、Caspase-3的表达情况。
　　 结果:
　　 1.PCR和双酶切分析结果显示成功构建了Ad-IL-24-OSM双基因共表达腺病毒载体。
　　 2.RT-PCR和Westernblot检测证实腺病毒介导的IL-24和OSM双基因均可在A375人黑色素瘤细胞中稳定转录及表达。
　　 3.Ad-IL-24-OSM双基因共表达腺病毒载体能显著抑制A375细胞的生长和诱导细胞凋亡，并显著优于Ad-IL-24、Ad-OSM单基因组(P＜0.05)。
　　 4.体内实验表明Ad-IL-24-OSM腺病毒载体可以显著抑制裸鼠人黑色素瘤移植瘤的生长，且均具有抑瘤增效的相加作用(Q=1.02)。
　　 5.细胞凋亡分子机制检测发现:Ad-IL-24-OSM能明显上调A375人黑色素瘤细胞P21、P53、Bax、Caspase-3和下调Cox-2、Bcl-2、CD34等细胞周期和凋亡相关蛋白的表达;且其效应均较Ad-IL-24、Ad-OSM更为显著。
　　 结论:
　　 Ad-IL-24-OSM双基因腺病毒共表达载体构建成功，在体内外均可明显抑制A375细胞的生长，诱导其凋亡，其机制可能是与上调p21、p53、bax和下调Cox-2、Bcl-2、CD34的基因表达水平，并通过激活Caspase-3凋亡途径诱导A375细胞凋亡和抑制肿瘤血管形成有关。