RNA干扰沉默CLN3基因对结肠癌细胞株HCT116增殖和凋亡影响的实验研究

摘要

目的：本课题旨在采用RNA干扰技术转染结肠癌细胞株HCT116，观察其对结肠癌HCT116细胞增殖、凋亡的影响，探讨CLN3基因在结肠癌中的作用，为进一步研究结肠癌的基因治疗提供理论基础和实验依据。
　　 方法：①设计并体外合成针对CLN3基因的小干扰RNA序列，以脂质体(lipofectamineTM2000)为载体转染人结肠癌细胞株HCT116，探索最佳转染效率所需的Lipofectamine2000与siRNA的浓度比，为后续实验提供最佳转染条件；②将合成的CLN3小干扰序列(CLN3-siRNA)转染结肠癌HCT116细胞，分别采用RT-PCR以及Western印迹检测转然后HCT116细胞CLN3基因在mRNA和蛋白水平表达情况，验证转染效果；③采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法，检测转然后24小时、48小时、72小时细胞的增殖变化，绘制生长曲线：④流式细胞术(FCM)AnnexinV/PI双染法检测转染后48小时HCT116细胞的细胞周期和细胞凋亡情况。
　　 结果：①取对数生长期HCT116细胞将每孔约1.0×105个细胞接种到6孔板培养24小时后转染，siRNA为80pmol/L，Lipofectamine2000与siRNA比例为Sul∶5ul(6孔板)时，转染效率较佳，继续提高siRNA和Lipofectamine2000的量不能明显提高转染效率；②转染CLN3-siRNA24小时后RT-PCR检测转染组CLN3的mRNA，mRNA表达明显下降，转染组与空白序列组及阴性对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)，空白序列组与阴性组比较，差异无显著统计学意义(P＞0.05)；转染CLN3-siRNA48小时后Western印迹检测转染组CLN3的蛋白，蛋白表达明显下降，转染组与空白序列组及阴性对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05），空白序列组与阴性对照组比较，差异无显著统计学意义(P＞0.05)；③CLN3-siRNA转染结肠癌细胞HCT11624时、48时、72时分别检测吸光度值明显降低，转染组与空白序列组及阴性对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05），空白序列组与阴性对照组比较，差异无显著统计学意义(P＞0.05)；④流式细胞术(FCM)AnnexinV/PI双染法检测转染后48时HCT116细胞的凋亡率明显增高，转染组与空白序列组及阴性对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05），空白序列组与阴性对照组比较，差异无显著统计学意义(P＞0.05)；检测细胞周期时，转染组与空白序列组及阴性对照组比较，细胞周期中各期细胞，无显著统计学差异(P＞0.05)，但转染组出现明显的凋亡峰。
　　 结论：①CLN3基因在结肠癌细胞株HCT116中高表达，CLN3-siRNA转染能有效沉默结肠癌HCT116细胞CLN3基因的过表达；②CLN3-siRNA转染可显著抑制结肠癌HCT116细胞的增殖；③CLN3-siRNA转染明显加速结肠癌HCT116细胞的凋亡，对其周期没有明显的影响。

目录

声明

序言

第一部分 CLN3基因RNA干扰序列的设计与验证

材料

方法

结果

讨论

结论

第二部分 RNAi沉默CLN3基因表达对结肠癌HCT116细胞增殖凋亡影响的实验研究

材料

方法

结果

讨论

结论

参考文献

全文结论

综述

主要缩略词表

攻读学位期间公开发表的论文

致谢