靶向Livin基因沉默对人结肠癌细胞株SW480生物学行为影响及作用机制的实验研究

摘要

目的：Livin是凋亡抑制蛋白（inhibitorsofapoptosisproteins，IAPs）中的一个最新成员，其主要在基因转录过程中发挥重要的作用。降低或消除Livin基因在肿瘤细胞中的过度表达，可解除Livin对肿瘤细胞凋亡的抑制作用，促进肿瘤细胞死亡和增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。RNA干扰(RNAi)能高效特异地调低目的基因的表达，并已广泛应用于肿瘤治疗的研究。本研究旨在采用RNA干扰技术转染结肠癌SW480细胞，观察其对人结肠癌细胞株SW480增殖凋亡的影响，并初步探讨Livin基因在结肠癌中的作用，为进一步研究结肠癌的耐药性及基因治疗奠定基础。
　　 方法：①设计并制备针对Livin基因的小干扰RNA序列，以脂质体（lipofectamineTM2000）为载体转染具有高侵袭潜能低分化人结肠癌细胞株SW480，流式细胞仪检测其转染效率，寻求SW480细胞株的最佳转染效率的条件；②将Livin-siRNA转染人结肠癌细胞株SW480，分别采用RT-PCR以及Western印迹检测转染后SW480细胞Livin和Caspase-3在mRNA和蛋白水平表达情况；四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同时间段细胞增殖活性的变化，并绘制生长曲线。③采用流式细胞术(FCM)检测计算对照组和实验组细胞的吸光度值以及细胞周期，细胞凋亡的情况。
　　 结果：①细胞数约为每孔1.2x105个，siRNA为80pmol，Lipofectamine2000与siRNA比例为4ul:4ul(6孔板)时，具有较佳的转染效率(93.9％)，继续提高siRNA浓度并不能明显提高转染效率；②转染Livin-siRNA后转染组LivinmRNA和蛋白表达明显下降，其差别具有统计学意义(p＜0.05)，显示出较佳的干扰效果；而Caspase-3mRNA的表达和蛋白的活性却得到增强，差别具有统计学意义(p＜0.05)。③转染了Livin-siRNA的结肠癌细胞增殖能力下降，差别具有统计学意义(p＜0.05)，凋亡增加，差别具有统计学意义(p＜0.05)，但对其细胞周期未见明显影响，差别无统计学意义(p＞0.05)。
　　 结论：①Livin-siRNA能有效沉默结肠癌细胞株SW480中Livin基因的过表达；②Livin基因通过Caspase蛋白酶水解途径来调控SW480细胞的生长；③Livin-siRNA转染可抑制结肠癌细胞株SW480的增殖并且能加速其凋亡，但可能不通过影响细胞周期来发挥作用。靶向RNAi干扰技术在结肠癌的基因治疗中具有潜在的价值，Livin可作为结肠癌基因治疗的新靶点。
　　 结肠癌(colorectalcancer，CRC)作为临床上最常见的一种恶性肿瘤，全世界每年新发病例约120万例，居全世界癌症病人发病率中的第四位[1]，并且以2%的速度不断递增，其中约有63万例死亡。从微观上讲，结肠癌的演变是一个多阶段、多基因、多水平的复杂分子病理模拟机制，但其真正的病因及机制到目前为止还没有相关文献做出过明确报道[2-3]。目前许多研究均证实了多数结肠癌的发生都会经历“正常黏膜—腺瘤—癌症”这一过程[4-5]，细胞凋亡和增殖的失衡是导致结肠癌的一个重要原因，不断探索结肠癌细胞的凋亡阻滞调节机制，可以为结肠癌的临床治疗策略的建立及治疗方案的确定提供有效的分子理论基础。凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisproteins，IAPs)是一类高度保守的、细胞内源性抗凋亡基因产物，能够保护特定的细胞抵抗相应刺激源所诱导的细胞凋亡，于上世纪90年代初由crook等[6]在杆状病毒Cydiapomonella颗粒体和Orgiapseudotsugatahe核多角病毒的研究中首次分离得到。Livin基因则是凋亡抑制蛋白家族中的最新成员之一，是一种重要的细胞凋亡调控因子。国内外的学者通过不同的技术手段在体内外检测发现Livin基因在众多肿瘤细胞株以及原发肿瘤组织中均表达异常增高，相反在大部分正常组织中低表达或不表达[7]，因此科学家们认为Livin基因的发现是肿瘤学领域的一个里程碑式发现，有可能成为诱导肿瘤细胞凋亡的一个新的靶向分子生物治疗位点。近几年来国内外的学者越来越重视在微观领域对Livin基因的研究并取得了一定的成果，本文就此作一篇综述。