探讨壳寡糖对坏死性小肠结肠炎新生大鼠肠黏膜的保护作用

摘要

目的：采取缺氧复氧、冷刺激和人工喂养多因素建立新生SD大鼠坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）模型；探讨用壳寡糖(chitosan oligosaccharide， COS)干预对NEC新生大鼠肠道的保护作用，为使用壳寡糖防治坏死性小肠结肠炎提供实验依据。
　　方法：选取孕期为同一日的5只清洁级健康雌性SD大鼠(由苏州大学实验动物中心提供)，待其自然分娩后，选取同日出生体重大于5克的新生鼠36只，平均体重约5.5±0.4克，雌雄不限，随机分为模型组（A组）、壳寡糖干预组（B组）及正常对照组（C组），每组12只。新生鼠前两日与母鼠同笼，自第三日开始，A组与B组脱离母鼠，给予人工喂养。A组中新生鼠给予配方乳人工喂养，每日2次连续3日给予100％氮气缺氧90秒、100％氧气复氧3分钟、4℃冷刺激10分钟；B组给予壳寡糖强化配方乳人工喂养，每日2次连续3日给予100％氮气缺氧90秒、100％氧气复氧3分钟、4℃冷刺激10分钟；C组为全程母乳喂养，不作任何处理。每日定时称量新生大鼠体重。第六日A、B和C三组均予以禁食一日。第七日采用颈椎脱臼法处死全部新生大鼠，取1.5～2cm回肠末段组织固定、切片，进行病理、TUNEL检测和电镜检查。将剩余的回肠组织制成组织匀浆，采用 ELISA双抗体夹心法检测肠组织匀浆中血小板活化因子(platelet-activating factor，PAF)和分泌型免疫球蛋白 A(secretary immunoglobulin A，SIgA)的含量。
　　结果：
　　1.各组一般生长发育情况
　　模型组和壳寡糖干预组新生大鼠在进行造模第二日，开始出现不同程度地活动度下降、腹胀、腹泻、消瘦，模型组中小鼠还出现抽搐，甚至死亡；正常对照组新生大鼠活动正常，反应灵敏，体重增加明显，食纳及排便均正常。在实验期间，于造模后第四日模型组中出现2例死亡，而壳寡糖干预组与正常对照组中无死亡。各组新生鼠体重均有所增长，增长幅度为：模型组0.96±0.23g，壳寡糖干预组1.99±0.56g，正常对照组4.27±0.28g，壳寡糖干预组体重增长明显大于模型组，两组差异具有统计学意义（P＜0.05）。
　　2.各组新生大鼠肠组织病理形态学
　　模型组、壳寡糖干预组和正常对照组肠组织病理改变评分分别为2.92±0.93、2.00±0.64、0.38±0.31，壳寡糖干预组与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.05）。模型组中肠损伤组织病理学评分范围为2～4分，具体表现是从黏膜下和(或)固有层中度分离、或从黏膜下和肌肉层中度水肿到全部绒毛消失肠壁坏死，符合典型NEC病理改变；壳寡糖干预组评分范围为1～3分，从轻微黏膜下和(或)固有层分离到黏膜下和(或)固有层重度分离、或从黏膜下和肌肉层重度水肿到局部绒毛消失脱落；正常对照组评分范围为0～1分，肠黏膜上皮组织结构完整。
　　3.各组新生大鼠肠组织PAF、SIgA含量
　　模型组、壳寡糖干预组和正常对照组肠组织PAF含量分别为33.91±1.87μg/ml、25.21±1.76μg/ml、17.55±1.64μg/ml，壳寡糖干预组肠组织中PAF含量明显低于模型组，两组数据相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
　　模型组、壳寡糖干预组和正常对照组肠组织中SIgA含量分别为24.75±1.83μg/ml、31.81±1.31μg/ml、36.33±1.58μg/ml。壳寡糖干预组肠组织中SIgA含量明显高于模型组，两组数据相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
　　4.电镜观察：模型组可见凋亡小体，提示处于凋亡晚期；壳寡糖干预组可见染色质靠近核膜边集，核孔扩大，提示处于凋亡早期；正常对照组可以见到细胞核占细胞体积的大部分，结构清晰，有核膜包被，提示正常细胞相。
　　5.TUNEL检测肠上皮细胞凋亡率（%）：模型组为44.17±4.37，壳寡糖干预组为27.33±5.21，正常对照组为9.00±2.86，壳寡糖干预组肠上皮细胞凋亡率明显低于模型组，两组数据相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
　　结论：
　　1.利用缺氧复氧、冷刺激和人工喂养的方法可建立新生大鼠坏死性小肠结肠炎模型。这种NEC模型的病理学变化更符合新生儿NEC的病理特征。
　　2.与模型组比较，壳寡糖干预组显示肠道粘膜损伤明显减轻，表明壳寡糖对坏死性小肠结肠炎新生大鼠肠道具有保护作用。其作用机理是通过抑制炎症级联反应中PAF的表达，促进肠道SIgA分泌，抑制肠粘膜上皮细胞的凋亡，减轻肠道组织损伤来实现的。

目录

封面

中文摘要

英文摘要

目录

引言

材料和方法

一、实验材料

二、实验方法

结果

一、一般状态

二、生长发育

三、新生鼠肠管大体所见

四、回肠组织病理改变

五、不同组间病理评分比较

六、各组肠组织匀浆中PAF、SIgA含量比较

七、肠组织电镜改变

八、肠粘膜上皮细胞凋亡检测

讨论

1、壳寡糖的结构及生物学作用

2、血小板活化因子在肠道损伤中的作用

3、分泌型免疫球蛋白A在肠道损伤中的作用

4、细胞凋亡

结论

附图

综述

1 壳寡糖的结构

2 壳寡糖的生物学作用

3 总结

参考文献

中英文双解缩略词表

攻读硕士学位期间公开发表的论文