纳米氧化钛长期暴露小鼠致肺毒性及其分子机制的研究

摘要

纳米二氧化钛(TiO2),是纳米材料的一种,是指大小在1~100 nm之间的超微颗粒,鉴于它独特的表面效应,量子尺寸效应和体积效应等特性,使其广泛应用于各个领域,如涂料、染料、印刷、医药、化妆品和食品等日常生活中,可通过空气、食物链进入人体,由于纳米材料比红细胞要小得多,理论上可以随血液到达生物体任意部位,它的应用安全性也引起科学界的广泛关注。呼吸道作为人体摄入纳米颗粒的主要途径之一,自然也成为其攻击的首要对象。引起肺部急慢性病变,如炎症、纤维化,甚至引起肺癌。目前,国内外已开展纳米TiO2对肺毒性的研究,但对其产生毒性的分子机制尚不明确。鉴于此,本论文开展了纳米 TiO2长期暴露小鼠致肺毒性及其分子机制的研究,本论文以不同剂量(2.5、5、10 mg/kg BW)的纳米TiO2(锐钛型5 nm)滴鼻处理小鼠90天,对其不同剂量引发的肺损伤及肺炎症的分子机制进行研究;另以单一剂量纳米TiO2(10 mg/kg BW)分别滴鼻处理小鼠15、30、45、60、75、90天对其引发的肺氧化损伤的分子机制进行研究;除此之外,本研究结合剂量效应和时间效应通过基因芯片技术深入研究肺损伤多基因共同作用的分子机制。本研究可为纳米材料长期暴露引起肺损伤评估提供重要的理论依据,让人们更加全面的评价纳米材料潜在的生物安全性。本研究主要内容包括：
　　⑴纳米TiO2可导致小鼠肺发生炎症反应,但其引发的炎症信号通路途径尚不明确。本实验以不同剂量(2.5、5和10 mg/kg)的纳米TiO2(5 nm)持续滴鼻处理小鼠90天,并测定肺组织中Ti的积累情况,肺系数变化情况及肺功能生化指标,评估肺组织损伤情况。研究结果表明,纳米TiO2处理组Ti元素积累于小鼠肺组织中,肺组织发生严重损伤如炎症反应,增加了小鼠肺组织中活性氧的积累以及脂质过氧化。RT-PCR和ELISA分析进一步显示纳米TiO2可显著诱导小鼠肺组织中NF-κB、COX-2、HO-1、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-18、IL-1β和CYP1A1的表达,降低IκB和HSP-70的表达。结果表明,TiO2暴露小鼠后能通过激活NF-κB信号通路而引发肺炎症反应。
　　⑵为了更深入研究纳米TiO2长期处理导致小鼠肺发生氧化损伤及相应的分子机制,用单一剂量的纳米TiO2(10 mg/kg BW)分别滴鼻处理小鼠15、30、45、60、75和90天,研究纳米TiO2造成肺组织发生氧化损伤的时间效应。研究发现纳米TiO2滴鼻处理小鼠90天后,肺超微结构观察到线粒体肿胀,核固缩,染色质凝集,板层小体疏散等细胞凋亡的典型症状,同时肺组织产生大量活性氧自由基(如O2·?、H2O2)。 RT-PCR和ELISA分析结果显示纳米TiO2处理小鼠15至60天后,能明显增加Nrf2、HO-1和GCLC的表达,处理75-90天后,其表达量显著减少。结果表明小鼠长期暴露于纳米TiO2能降低Nrf2的表达,进一步降低其下游的抗氧化基因HO-1和GCLC的表达,进而诱发小鼠肺组织发生氧化损伤。
　　⑶前两部分实验已经从剂量效应和时间效应证明了纳米TiO2能导致肺毒性效应,但对于长期暴露小鼠所造成的肺损伤多基因共同作用的分子机制尚不明朗。所以在本研究中,我们利用基因芯片技术检测纳米TiO2(2.5、5、10 mg/kg BW)连续滴鼻处理小鼠90天,检测肺基因表达谱的变化。结果显示长期暴露小鼠后肺组织发生严重的炎症反应,肺间质增厚以及肺水肿,同时肺细胞凋亡并伴随肺生化功能发生障碍。抗氧化分析结果表明肺组织中脂质、蛋白质和核酸的过氧化产物--丙二醛(MDA)、羰基(Carbonyl)和8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的水平显著上升;另外,基因芯片数据显示纳米TiO2长期滴鼻处理小鼠后有521个基因显著性差异表达,这些基因涉及免疫/炎症反应、细胞凋亡、氧化应激、代谢过程、应激反应、信号传导、细胞增殖、细胞骨架、细胞分化以及细胞周期等生物过程。本文重点讨论了与免疫炎症反应有关的β-防御素(Defb4)、H2-Oa、几丁质酶3(Chi3l3)、花生四烯酸-5-脂氧合酶激活蛋白(Alox5ap)、白介素10(IL-10),与细胞凋亡有关的蛋白质二硫键异构酶2(Pdi2)、烟酸受体1(Niacr1)、腺苷脱氨酸(Ada)、鞘氨醇激酶2(Spk2)、红白血病病毒致癌基因同源染色体2(v-erb-b2),与细胞周期有关的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1a(Cdkn1a)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1c(Cdkn1c),氧化应激有关的晶状体-αb(Cryαb)、烷基化同源蛋白7(Alkbh7)功能相关基因差异表达的作用机制。

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第一部分 研究背景

1 纳米氧化钛颗粒特性及应用

2 纳米氧化钛侵入机体途径及侵入机制

3 纳米氧化钛颗粒生物毒性研究

4本研究的内容及意义

第二部分 纳米TiO2导致小鼠肺损伤的剂量效应及其分子机制

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

4结论

第三部分 纳米TiO2导致小鼠肺损伤的时间效应及其分子机制

1 材料与方法

2 结果分析

3 讨论

4. 结论

第四部分 纳米TiO2暴露导致小鼠肺损伤的多基因相互作用机制

1 材料和方法

2 结果

3讨论

4总结

结论与展望

攻读学位期间公开发表的论文

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