川续断皂苷VI治疗非酒精性脂肪性肝炎及其机制研究

摘要

目的:探讨川续断皂苷 VI对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的防治作用及其作用机制。
　　方法:应用ob/ob雄性小鼠建立非酒精性脂肪性肝炎模型,36只ob/ob小鼠,随机分成模型组和川续断皂苷 VI低、中、高剂量组,正常组小鼠用 C57BL/6J雄性小鼠代替(每组9只)。正常组喂食基础饲料,模型组和各治疗组喂食高脂饲料,喂食高脂饲料的同时开始给药,川续断皂苷VI各剂量治疗组分别按30、60、120mg/kg·d腹腔注射给药,正常组和模型组分别腹腔注射等量生理盐水,连续给药4周后取材;称量各组小鼠体重,肝组织湿重,计算各组肝指数;制备肝线粒体和组织匀浆,检测肝线粒体膜电位变化和线粒体ROS含量;进行血脂和肝功能检测;采用HE染色法观察肝组织病理学改变,电镜法观察肝组织细胞超微结构变化;采用硫代巴比妥酸(TBA)法检测肝组织丙二醛(MDA)含量;比色法检测肝组织谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性;Western blot检测 P-JNK、Bax、Bcl-2、Cytochrome C蛋白表达情况。采用棕榈酸(PA)诱导大鼠BRL细胞建立非酒精性脂肪性肝炎体外模型,根据实验要求设置对照组、PA处理组、川续断皂苷VI低、中、高浓度预保护组。采用MTT法检测PA对BRL细胞活性的影响;Bodipy493/503染色法检测BRL细胞内脂质沉积;DAPI染色法检测细胞凋亡形态学变化;Annexin V-FITC流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot检测P-JNK、Bax、Bcl-2蛋白的表达情况。
　　结果:
　　1、动物实验结果:(1)与正常组相比,模型组小鼠体重和肝指数明显增加(P<0.05),与模型组相比,川续断皂苷VI各剂量组体重、肝指数均有所降低,其中高剂量组存在统计学差异(P<0.05);(2)与正常组相比,模型组小鼠肝功能(ALT、AST)受损严重,组织病理学显示肝小叶结构排列紊乱,肝细胞出现不同程度的脂肪变性,细胞体积明显变大,细胞核被挤在边缘,细胞质内存在大量脂肪空泡,形态与脂肪细胞类似,伴有不同程度的细胞碎屑样坏死和炎细胞浸润,部分肝组织出现轻、中度炎症及凋亡小体形成等病理改变,出现NASH病理特征,血脂(TC、TG、LDL-C)及肝组织氧化应激指标(MDA)均明显升高(P均<0.05),血脂HDL-C以及肝组织GSH-PX、SOD的活性均明显降低(P均<0.05);川续断皂苷VI高剂量组与模型组相比,血清ALT、AST水平和肝组织脂肪变性、炎症程度均显著下降,血清TC、TG、LDL-C和肝组织MDA含量明显降低(P均<0.05)HDL-C及GSH-PX、SOD的活性增加(P均<0.05);(3)模型组小鼠肝线粒体膜电位降低、ROS含量升高,与正常组相比有显著性差异(P<0.05);川续断皂苷 VI处理组线粒体膜电位升高、ROS含量降低,和模型组相比有显著性差异(P<0.05),并呈现剂量依赖性;(4)与正常组小鼠相比,模型P-JNK、Bax和Cytochrome C蛋白表达增强,Bcl-2蛋白表达水平下降(P<0.05);川续断皂苷VI各剂量组P-JNK、Cytochrome C和Bax蛋白表达较模型组相比降低,Bcl-2蛋白表达水平增强,其中川续断皂苷VI高剂量组具有统计学意义(P<0.05)。
　　2、细胞实验结果:(1)不同浓度(50、100、150、200μmol/L)的PA作用于BRL细胞24h和48h后,细胞存活率较对照组均有下降,当细胞浓度为大于150μmol/L作用细胞48 h存活率低于50％,因此,为了降低PA对肝细胞的毒性,在后续实验中,我们选用48h IC50浓度(150μmol/L)作为PA最佳诱导浓度(2)PA诱导的BRL细胞48h,细胞内脂质沉积明显,川续断皂苷VI高浓度组可有效抑制脂质沉积(P<0.05)。(3)PA诱导的BRL细胞48h,与对照组相比,细胞凋亡明显增加(P<0.05)、凋亡细胞发生形态变化;与PA组相比,川续断皂苷VI各浓度组可有效抑制肝细胞凋亡的发生。(4)PA诱导的BRL细胞P-JNK、Bax蛋白表达量明显增加,Bcl-2蛋白表达量显著减少(P<0.05);与PA组相比,川续断皂苷VI各浓度组可不同程度抑制P-JNK、Bax蛋白的表达,促进Bcl-2蛋白表达,有效抑制肝细胞凋亡的发生,中、高浓度组差异具有统计学意义(P<0.05)。
　　结论:
　　1.本实验成功制备与人体NASH病理特点比拟的实验性小鼠模型,以及NASH体外模型,为NASH发病机制及药物等干预性研究提供了较好实验模型。
　　2.川续断皂苷VI可能通过抑制ob/ob小鼠体内氧化应激、抑制肝细胞凋亡,发挥肝功能保护作用。
　　3.川续断皂苷VI可能通过缓解棕榈酸诱导肝细胞脂毒性,减少肝细胞内脂质沉积,抑制细胞凋亡,发挥肝细胞保护作用。
　　4.川续断皂苷VI治疗NASH作用机制可能与其通过抑制JNK蛋白磷酸化,从而抑制促凋亡蛋白Bax表达、促进抗凋亡蛋白 Bcl-2表达,抑制线粒体细胞色素C的释放,最终阻断线粒体凋亡通路有关,但其具体机制仍需进一步深入研究。

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前言

第一部分 川续断皂苷VI治疗ob/ob小鼠非酒精性脂肪性肝炎药效学研究

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分 川续断皂苷VI抑制棕榈酸诱导的肝细胞脂毒性作用的药效学研究

材料与方法

结果

讨论

小结

第三部分 川续断皂苷VI治疗非酒精性脂肪性肝炎的机制研究

材料与方法

结果

讨论

小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的论文

英文缩略词表

综述

参考文献

致谢