体外新生大鼠海马缺氧缺血模型中自噬相关分子的表达及Ca-A/K通道在自噬中的作用机制

摘要

目的：通过观察体外新生大鼠缺氧缺血性损伤模型，了解海马神经元的损伤情况，以及损伤后不同时间点及各组间细胞自噬变化和Ca-A/K通道亚基情况，探讨自噬抑制剂3-methyladenine（3-MA）对自噬调节及对细胞存活的影响，并初步研究缺氧缺糖后Ca-A/K通道亚基变化与自噬的关系。
　　方法：采用新生24小时以内的SD（Sprague Dawley）大鼠进行海马细胞原代培养，行氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation，OGD)的处理方法，模拟神经元缺氧缺血模型。选取氧糖剥夺后0h、6h、12h、24 h、48 h、72 h、96 h七个时间点，通过Western blot及RT-qPCR法测定氧糖剥夺前后海马神经元自噬相关蛋白（LC-3、Beclin-1）、mRNA的变化和Ca-A/K通道亚基（GluR1、GluR2、GluR3）的蛋白变化；透射电镜下检测自噬的特异性结构；用CCK8法检测细胞活性，采用Fluo-3AM流式检测缺氧缺血后[Ca2+]i的水平变化，应用自噬抑制剂3-MA干预后，行上述检测，初步探讨自噬和Ca-A/K通道的关系及可能机制。
　　结果：
　　1、电镜结果显示，相比正常条件下的神经元，缺氧缺糖后神经元细胞浆内有大量自噬体形成；预先采用3-MA干预的细胞组也有自噬体形成，但比缺氧缺糖组明显降低。
　　2、RT-qPCR结果显示，与对照组相比，缺氧缺糖组0.5h和1h组LC3、Beclin-1均表达上升，缺氧缺糖0.5h组在0h表达就开始上升，48h达到高峰后开始下降。缺氧缺糖1h组则72h达到高峰后下降，且比缺氧缺糖0.5h组表达量增高；3-MA干预1h组则在模型后6h就呈现下降，12h趋向正常水平。
　　3、Western blot结果发现，与对照组相比，缺氧缺糖0.5h组和1h组LC3、Beclin-1均表达升高，缺氧缺糖0.5h组在6h达到高峰，48h后开始下降。缺氧缺糖1h组则12h达到高峰后呈现下降趋势；且比缺氧缺糖0.5h组表达增强，3MA干预1h组在6h后呈现下降趋势；缺氧缺糖1h组的GluR1、GluR3在缺氧缺糖后6h表达上升，持续到24h后下降，而GluR2则在6h表达下降，持续到24恢复正常水平。
　　4、CCK8结果显示，缺氧缺糖损伤恢复正常条件24h后细胞存活率为71±1％，48h存活率为80±4%，相应的在每个时间点给予3-MA预处理后细胞存活率分别为75±5%、82±4%，无显著性差（p>0.05）。
　　结论：
　　1．成功培养了原代海马细胞并建立了体外缺氧缺血模型。
　　2．缺氧缺糖后自噬标记蛋白LC-3、Beclin-1及Ca-A/K通道亚基GluR1、GluR2、GluR3的表达发生变化。
　　3.在一定程度损伤内，细胞自噬会随缺氧缺糖时间延长而增加。
　　4.3-MA可影响上述自噬相关蛋白在缺氧缺糖中的表达，抑制自噬减轻细胞损伤。
　　5.缺氧缺糖损伤后，Ca-A/K通道发生结构改变，提示形成以GluR2亚基减少为主的新通道，介导Ca2+的快速内流，诱导细胞自噬。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

引言

一、缺氧缺血性脑病研究状况及体外研究其重要性

二、缺氧缺血性脑损伤变化中自噬的参与及重要性

三、Ca-A/K通道在脑损伤中的作用

第一部分 原代海马细胞培养及不同程度缺氧缺血模型下自噬的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

第二部分 海马神经元体外缺氧缺血后的自噬中相关机制的探讨及3-MA对神经元自噬影响的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

实验不足及展望

参考文献

综述:自噬在缺氧缺血损伤中的研究进展

英汉缩略语名词对照

研究生期间发表及待发表文章

本课题资助项目

致谢