对乙酰氨基酚诱发小鼠肝脏黑化机制及其无脊椎动物快速检测模型

摘要

对乙酰氨基酚（APAP）是临床广泛使用的高效解热镇痛类非处方药。随意性和复方使用过量APAP类药物引起的肝毒性，在包括美国在内的许多国家已经成为急性肝衰竭（ALF）的主要原因之一。本文以哺乳类小鼠以及无脊椎模式动物家蚕为模型，发现了APAP诱导小鼠ALF发生前出现的肝脏黑化现象，进一步在家蚕体内观察到具有时间和剂量效应的APAP诱导的体表黑化现象，并以解毒代谢组织脂肪体模拟小鼠肝脏复制出APAP诱发的ALF，系统研究和平行比较了两种动物模型APAP诱发的黑化作用生化机制。相关结果如下：
　　1.APAP引起家蚕脂肪体与小鼠肝脏相似的急性损伤
　　家蚕皓月品种5龄48 h幼虫，以及体重20 g左右的ICR小鼠，经口给药APAP后0.5 h-2 h，HPLC方法在小鼠循环血液（血浆）与肝脏，家蚕循环血淋巴（血浆）以及脂肪体中追踪到APAP原药快速出现，并且都呈现典型的时间/剂量效应，其中家蚕无论是血浆还是脂肪体中原药的含量均显著高于小鼠血浆和肝脏。
　　经口给药APAP后16 h，组织HE染色切片观察结果表明，150 mg/kg以上剂量诱导了小鼠肝脏细胞的急性坏死性损伤，并且有显著的剂量效应；家蚕脂肪体在剂量达3600 mg/kg时能够观察到急性坏死性损伤。血浆中典型急性肝衰竭酶活性指标测定结果显示，两种动物模型的丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）活性，伴随着肝脏/脂肪体细胞急性坏死性损伤而显著升高。显示高浓度的APAP暴露，能够诱发小鼠的肝脏以及家蚕的脂肪体发生相似的急性坏死性损伤，表明家蚕脂肪体能够替代小鼠的肝脏开展APAP的组织损伤机制研究。
　　2.黑化是肝脏/脂肪体损伤的可靠指标
　　探究小鼠肝脏以及家蚕脂肪体发生损伤的同时，是否有更为便捷的外观检测方法。结果显示，小鼠经口给药600 mg/kg APAP时肝脏发生了黑化，给药后0 h-4 h黑化程度不断增加，随后逐渐减弱，至给药后32 h肝脏组织恢复至对照程度，呈典型的时间-剂量效应，观察其体表颜色无明显变化。家蚕经口给药APAP后，脂肪体颜色未见明显改变但体表出现黑斑，且剂量越大，黑斑黑化程度越严重，黑化出现的时间越早，具有典型的时间-剂量效应。
　　小鼠经口给药APAP后1 h-32 h，对血浆以及肝脏黑色素含量进行调查，结果显示处理组黑色素含量明显高于对照组，呈时间-剂量效应；家蚕经口给药APAP后，高剂量处理组黑色素生成限速酶酚氧化酶（PO）的活性在给药后0.5 h-4 h显著高于对照组，随后逐渐恢复。表明，伴随着肝脏/脂肪体受损的同时，小鼠的循环血液和肝脏中出现了黑色素积累与肝脏黑化，而家蚕在循环血液中出现黑色素合成代谢增强的同时，体色黑化能够显示APAP暴露后脂肪体的同步损伤。
　　3.小鼠和家蚕黑色素形成代谢通路的比较
　　经口给药APAP后1 h-8 h，HPLC方法测定血浆中黑色素代谢起始底物苯丙氨酸（Phe）以及酪氨酸（Tyr）的含量，得出无论在小鼠还是家蚕中暴露APAP组与对照组相比Phe含量均先下降，但在动物适应性恢复后，Phe含量出现升高，其中小鼠的恢复速度快于家蚕；Tyr的含量先升高后下降，其中家蚕开始下降的时间和下降幅度显著快/大于小鼠。结果表明APAP诱导了从Phe生成Tyr的代谢水平升高。
　　对Tyr的下游代谢通路进行调查，结果显示小鼠经口给药APAP后4 h，血浆中肾上腺素（EPI）含量明显高于对照组，表明APAP诱导的Tyr既用于形成黑色素也合成EPI。家蚕Tyr用于形成多巴，多巴进一步代谢为多巴胺和多巴醌，APAP处理后的家蚕血浆中多巴含量减少，而多巴胺的含量显著增加，表明在家蚕体内APAP诱导多巴胺通路代谢活性也得到显著提升，最终代谢生成黑色素；而小鼠体内多巴胺支路形成了EPI，只有多巴醌支路最终合成了黑色素。因此，暗示使用家蚕动物模型比小鼠具有更高灵敏性来评判APAP诱导的黑色素生成代谢影响。
　　本文结论：高剂量APAP诱导的哺乳动物肝脏急性衰竭损伤之前，循环血中黑色素生成代谢水平显著升高并伴随出现肝脏黑化。无脊椎模式动物家蚕的体表黑化面积有望成为检测APAP类药物组织代谢毒性的敏感外观指标。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

第一章 序论

1 文献综述

2 研究目的与研究内容

3 研究技术路线

第二章 APAP诱发小鼠肝脏黑化机制及其无脊椎动物快速检测模型

1 实验材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 结论

1 结论

2 论文创新点

3 后续研究展望与建议

参考文献

发表论文与参与项目

攻读学位期间公开发表论文

攻读学位期间国际会议发表论文

攻读学位期间投稿论文

攻读学位期间参与项目

附录

附录1 文中主要缩略词表

附录2 小鼠（Mus）与家蚕（Bm）血浆中游离氨基酸含量

致谢