蛋白二硫键异构酶PDI双重调控血小板和凝血系统活化的作用及其机制研究

摘要

研究背景和目的：
　　血栓形成由血小板活化和凝血系统激活两个环节构成。蛋白二硫键异构酶（protein disulfide isomerase,PDI）家族的原型成员PDI是该家族的主要成员。迄今，已有多项研究应用抗PDI抗体RL90以及PDI抑制剂，报道了PDI在血小板积聚和纤维蛋白形成中发挥重要作用。但是，我们近来发现抗体RL90以及PDI抑制剂对PDI的抑制作用没有特异性。而且，应用新建立的组织特异性PDI基因敲除小鼠模型，我们近一步发现血管内PDI的缺陷导致体内血小板积聚和纤维蛋白形成显著性减弱。这些新的观察结果提示，PDI对血小板活化和凝血系统激活具有双重调控作用。本课题的研究目的是明确血液和血管组织来源的PDI在血小板和凝血系统活化中的作用，解析PDI调控血小板重要受体及凝血蛋白的作用机制，尤其是判定PDI蛋白的功能域。因此，本课题为阐明血栓形成的分子和细胞机制提供新的认识，并揭示新的抗血栓形成的干预靶点。
　　研究方法：
　　本课题综合应用PDI重组蛋白，血小板（Pf4-Cre）特异性PDI敲除小鼠，血管壁-造血系（Mx1-Cre）特异性PDI敲除小鼠，以及通过实验筛选出的PDI全身敲除基础上转入PDI突变基因PDI（ss-oo）小鼠等多种研究工具，从生理性止血，体内血栓形成，体外血小板生理功能（包括聚集、颗粒释放、整合素IIb3的活化）及体外凝血酶生成等四个方面，系统地研究了PDI在血小板和凝血系统活化过程中的作用及其机制。
　　研究结果：
　　（1）RL90抗体能识别重组人PDI蛋白，不识别重组小鼠PDI蛋白，RL90抗体抑制ERp57蛋白酶活性，RL90抗体抑制PDI敲除血小板的聚集功能，RL90抗体抑制PDI敲除血小板的P-selectin表达和整合素?IIb?3活化；
　　（2）Quercetin-3-O-rutinoside（Rutin）抗体抑制ERp57蛋白酶活性，Rutin抗体抑制PDI敲除血小板的聚集功能；
　　（3）重组PDI ss-ss和PDI oo-ss蛋白促进血小板聚集而重组PDI oo-oo和PDI ss-oo蛋白抑制血小板聚集,PDI oo-oo蛋白延长小鼠尾巴出血时间（3.601±0.4068 v.s.7.717±1.3, p=0.0059）；
　　（4）PDI的缺失明显抑制血小板聚集（p<0.001）、整合素IIb3活化（p<0.05）和-颗粒释放（p<0.05），PDI oo-ss蛋白补偿PDI缺乏血小板的聚集功能（p=0.007），β3的缺陷抑制重组PDI蛋白和血小板的结合（p=0.0162），血小板PDI的缺失明显延长小鼠尾巴出血时间（3.369±0.6597 v.s.8.00±1.013, p=0.0003）和FeCl3诱导的颈动脉闭塞时间（4.914±0.3113 v.s.8.846±0.8364，p<0.0001）；
　　（5）内皮-造血系PDI的缺乏不仅明显抑制血小板积聚(p<0.0001)，还抑制纤维蛋白形成（p=0.033），PDI重组野生型蛋白促进组织因子介导的凝血酶的生成（p=0.0047），PDI重组突变蛋白抑制活化血小板依赖的凝血酶的生成（p<0.0001）；
　　（6）全身PDI基因敲除小鼠以及全身敲除基础上转入PDI第一活性位点突变基因小鼠（PDI oo-ss）都有胚胎致死的表型，而全身敲除基础上转入PDI第二活性位点突变基因小鼠（PDI ss-oo）可以逃脱胚胎致死的表型。应用PDI(ss-oo)小鼠模型，我们发现血小板聚集（p<0.001）、整合素IIb3活化（p<0.05）、-颗粒释放（p<0.05）均受抑制，PDI（ss-oo）小鼠血小板的铺展功能相比WT血小板明显减弱（p=0.0041），FeCl3诱导PDI ss-oo小鼠颈动脉血栓形成，血管闭塞时间延长（p=0.0047），PDI ss-oo小鼠出血时间延长（4.142±0.675 v.s.6.896±0.733，p=0.0054），激光诱导PDI ss-oo小鼠提睾肌动脉血栓形成模型中，血小板积聚（p<0.0001）和纤维蛋白形成（p=0.0003）均受抑制；
　　（7）体内注入第一活性功能域CGHC失活，第二活性功能域CGHC正常的PDI oo-ss蛋白能补偿Mx1-Cre/PDIfl/fl小鼠和PDI ss-oo小鼠体内血小板积聚和纤维蛋白形成的缺陷。
　　研究结论：
　　PDI在血栓形成和生理性止血中发挥重要作用；PDI双重调控血小板和凝血系统活化两个关键环节，其发挥作用的功能域是其第二活性位点CGHC部位；血小板和血管壁细胞均是PDI的来源。

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一、引 言

二、材料与方法

（一）材料

（二）实验方法

三、实验结果

（一）抗体RL90与PDI抑制剂对PDI的抑制作用没有特异性

（二）PDI双重调控血小板和凝血系统的活化

（三）PDI的第二活性位点在血小板活化和血栓形成中相对重要

四、讨 论

五、结 论

参考文献

文献综述: 二硫键异构酶双重调控血小板和凝血系统活化的作用及其研究进展

攻读学位期间发表的论文及会议摘要

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