沉默TIGAR增加β-七叶皂苷钠对肠癌细胞抗肿瘤作用的机制研究

摘要

目的：研究β-七叶皂苷钠对肠癌细胞 TIGAR（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator）蛋白表达的影响，并研究TIGAR在β-七叶皂苷钠对肠癌细胞抗肿瘤治疗中的作用，进一步探讨TIGAR影响β-七叶皂苷钠对肠癌细胞的抗肿瘤作用的相关机制。
　　方法：通过Western Blot法，研究β-七叶皂苷钠对肠癌细胞HCT116 TIGAR蛋白表达的影响；采用小干扰RNA技术沉默肠癌细胞TIGAR表达后通过CCK-8及克隆形成实验分别检测沉默TIGAR表达结合β-七叶皂苷钠治疗对肠癌细胞HCT116生存总体情况的影响；Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测β-七叶皂苷钠治疗联合沉默TIGAR对肠癌细胞HCT116凋亡的影响情况，并用Western blot检测凋亡相关蛋白如PARP、Bcl-2、Bax、Caspase-3；2’,7’-二氯二氢荧光素双醋酸盐（DCFH2-DA）标记流式细胞术、二氢乙啶（Dihydroethidium，DHE）探针标记细胞检测细胞内活性氧（ROS）水平；彗星实验检测HCT116细胞DNA损伤情况；Western Blot检测经过相应实验处理后HCT116细胞的DNA损伤标志蛋白γ-H2AX，和DNA损伤修复相关蛋白，如p-ATM、Cdk5的表达。
　　结果：研究β-七叶皂苷钠对肠癌细胞HCT116TIGAR表达的影响，我们使用不同浓度的β-七叶皂苷钠作用于肠癌 HCT116细胞，结果显示：较低浓度的β-七叶皂苷钠可诱导HCT116细胞TIGAR表达上调，浓度40μg/ml时最高，之后表达下降；下一步研究β-七叶皂苷钠作用于肠癌HCT116细胞不同时间后TIGAR的变化情况，结果显示：较短时间内的β-七叶皂苷钠可诱导HCT116细胞TIGAR表达上调，但是经过较长时间β-七叶皂苷钠作用后，我们观察到TIGAR表达会有下调的表现。为了探讨β-七叶皂苷钠诱导的TIGAR高表达对肠癌细胞HCT116抗肿瘤治疗中的作用，我们首先利用TIGAR siRNA沉默肠癌细胞HCT116 TIGAR表达，然后通过CCK8实验、克隆形成实验和流式细胞术检测其处理的效果，结果发现，沉默TIGAR表达联合β-七叶皂苷钠作用后，肠癌HCT116细胞的存活率出现显著下降，并且细胞凋亡显著增加。
　　肿瘤的治疗与多种机制相关，其中ROS适应性反应、细胞凋亡及细胞DNA损伤修复在肿瘤治疗的形成中起着重要作用，TIGAR位于 p53的下游基因，能抑制细胞糖酵解过程，而增加磷酸戊糖通路（PPP）产生的NADPH从而降低细胞内ROS的含量，接着降低了ROS导致的细胞凋亡和ROS诱导的DNA损伤修复。所以，为了进一步探讨β-七叶皂苷钠对肠癌细胞抗肿瘤作用的机制，我们分别从细胞凋亡、细胞DNA损伤修复两个方面来进行研究。
　　首先，沉默TIGAR表达显著增加β-七叶皂苷钠所诱导的肠癌细胞HCT116的凋亡，这些结果与ROS水平增加、Caspase-3激活等相关。以上结果显示，沉默TIGAR表达增加β-七叶皂苷钠对肠癌细胞的治疗效果与沉默TIGAR表达增加细胞凋亡有关。
　　其次，沉默TIGAR表达亦可显著增加β-七叶皂苷钠所导致的肠癌细胞DNA损伤，当我们给予PPP通路产物NADPH时，我们发现可部分减轻DNA损伤情况。提示：沉默TIGAR表达除了通过抑制PPP通路增加β-七叶皂苷钠诱导的肝癌细胞DNA损伤外，还有其他机制的存在。随后的实验发现，TIGAR是通过调节Cdk5-ATM信号通路，参与细胞DNA损伤修复的过程。综上所述，TIGAR通过两条途径（即PPP途径和Cdk5-AMT信号通路）调控β-七叶皂苷钠对肠癌细胞DNA的损伤与修复，影响β-七叶皂苷钠对肠癌细胞抗肿瘤治疗效果。
　　结论：β-七叶皂苷钠诱导肠癌细胞HCT116 TIGAR的表达；沉默TIGAR表达增加β-七叶皂苷钠对肠癌细胞的抗肿瘤敏感性，其机制涉及细胞凋亡增加、细胞DNA的损伤与修复。TIGAR表达在β-七叶皂苷钠对肠癌细胞的抗肿瘤治疗中的作用提示TIGAR成为抗肿瘤治疗作用靶点的可能，也为临床抗肿瘤治疗尤其是β-七叶皂苷钠对肠癌的抗肿瘤治疗提供理论基础及依据。

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研究背景

第一部分 沉默TIGAR通过调控细胞凋亡增加β-七叶皂苷钠的抗肿瘤作用

第一节 β-七叶皂苷钠诱导肠癌细胞TIGAR表达

第二节 沉默TIGAR表达增加β-七叶皂苷钠对肠癌细胞的抗肿瘤作用

第二部分 沉默TIGAR通过调控DNA损伤修复增加β-七叶皂苷钠的抗肿瘤作用

第一节 沉默TIGAR表达增加β-七叶皂苷钠诱导的肠癌细胞DNA损伤

第二节 沉默TIGAR增加β-七叶皂苷钠诱导的肠癌细胞DNA损伤的机制研究

讨论

全文结论

参考文献

综述: β-七叶皂苷钠药理作用机制的国内外研究进展

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