通过沉默ARPC4基因来抑制人结直肠癌细胞迁移的siRNA及其应用

摘要

本发明公开了一种通过沉默ARPC4基因来抑制人结直肠癌细胞迁移的siRNA及其应用。siRNA为siRNA496或siRNA538或siRNA679。本发明方法利用siRNA沉默ARPC4基因，再采用western blotting方法、CCK‑8法、流式细胞术和Transwell检测ARPC4基因对结直肠癌细胞迁移能力的变化，siRNA能够有效下调人结直肠癌SW620细胞中ARPC4基因的表达，减弱细胞的迁移侵袭，因此，通过siRNA特异性干预ARPC4基因的表达，使得ARPC4基因成为基因治疗结直肠癌的一个新靶点。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种通过沉默ARPC4基因来抑制人结直肠癌细胞迁移的siRNA及其应用。

背景技术

结肠直肠癌(carcinomaofcolonandrectum)胃肠道中常见的恶性肿瘤，早期症状不明显，随着癌肿的增大而表现排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状，晚期则表现贫血、体重减轻等全身症状。其发病率和病死率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌，严重危胁人类的身心健康，在癌症中的发病率约为9.7％。

肿瘤细胞的侵润性受肿瘤—基质相互作用的调控，在结直肠癌中，Arp2/3复合体在基质细胞附近表达，它的形成提高了基质细胞与成瘤细胞之间的运动性，进而为这两种细胞的侵润性提供更适合的环境。

肌动蛋白相关蛋白2/3复合体是细胞骨架的重要组成部分，能够促进新微丝核化，广泛参与细胞形状的维持、细胞运动、胞质分裂和细胞移动等功能，ARPC4与ARPC2构成该复合体的中心，在该复合体的生物学功能上扮演重要角色。在胰腺癌，结直肠癌等多种癌细胞中异常高表达。ARPC4是arp2/3复合体的组成亚基之一，它具有控制肌动蛋白(actin)在细胞内的成核过程，与下游基因产生融合蛋白以及影响胰腺癌细胞的迁移等作用。但目前未见采用siRNA沉默SW620细胞系中的ARPC4基因来抑制其迁移的相关报道。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种通过沉默ARPC4基因来抑制人结直肠癌细胞迁移的siRNA及其应用，通过siRNA沉默ARPC4基因的表达，可有效抑制人结直肠癌细胞的侵袭力。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种通过沉默ARPC4基因来抑制人结直肠癌细胞迁移的siRNA，该siRNA为siRNA496或siRNA538或siRNA679；

siRNA496Sense：5＇-GAGCAGAGAACUUCUUUAUTT-3＇(SEQ ID No:1)；

siRNA496Antisense：3＇-AUAAAGAAGUUCUCUGCUCTT-5＇(SEQ ID No:2)；

siRNA538Sense：5＇-GGUAUGAUAUCAGCUUUCUTT-3＇(SEQ ID No:3)；

siRNA538Antisense：3＇-AGAAAGCUGAUAUCAUACCTT-5＇(SEQ ID No:4)；

siRNA679Sense：5＇-GCUGAAGAGUUCCUUAAGATT-3＇(SEQ ID No:5)；

siRNA679Antisense：3＇-UCUUAAGGAACUCUUCAGCTT-5＇(SEQ ID No:6)。

进一步地，siRNA所作用的结直肠癌细胞系为HT-29、HCT-116、SW620或SW-1116。

进一步地，结直肠癌细胞系为SW620。

上述siRNA在制备抑制人结直肠癌细胞迁移药物中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明方法利用siRNA沉默ARPC4基因，再采用western blotting方法、CCK-8法、流式细胞术和Transwell检测ARPC4基因对结直肠癌细胞迁移能力的变化，siRNA能够有效下调人结直肠癌SW620细胞中ARPC4基因的表达，减弱细胞的迁移侵袭，通过siRNA特异性干预ARPC4基因的表达，使得ARPC4基因成为基因治疗结直肠癌的一个新靶点。

说明书附图

图1为不同结直肠癌细胞系中ARPC4基因的表达量图谱；

图2为不同siRNA转染效果对比图；

图3为转染后的细胞光吸收值图谱；

图4为转染后细胞的生长曲线图；

图5A～D为ARPC4-siRNA538对SW620细胞周期的影响图谱；

图6为实验组、对照组、空白组的穿膜细胞数量图谱；

图7A为E-cadherin基因表达量图谱；

图7B为vimetin基因表达量图谱；

图7C为PCNA基因表达量图谱。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例

1、由上海吉玛制药有限公司设计合成3个siRNA序列，根据靶序列对应的cDNA起始位点命名为siRNA496、siRNA538和siRNA679，另外还设计有一条阴性对照(negativecontrol,NC)序列；

siRNA496Sense：5＇-GAGCAGAGAACUUCUUUAUTT-3＇(SEQ ID No:1)；

siRNA496Antisense：3＇-AUAAAGAAGUUCUCUGCUCTT-5＇(SEQ ID No:2)；

siRNA538Sense：5＇-GGUAUGAUAUCAGCUUUCUTT-3＇(SEQ ID No:3)；

siRNA538Antisense：3＇-AGAAAGCUGAUAUCAUACCTT-5＇(SEQ ID No:4)；

siRNA679Sense：5＇-GCUGAAGAGUUCCUUAAGATT-3＇(SEQ ID No:5)；

siRNA679Antisense：3＇-UCUUAAGGAACUCUUCAGCTT-5＇(SEQ ID No:6)；

NC Sense：5＇-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3＇(SEQ ID No:7)；

NC Antisense：3＇-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-5＇(SEQ ID No:8)。

2、采用western blotting实验确定ARPC4基因异常高表达细胞系，其具体过程为：

将人结直肠癌细胞系HT-29、HCT-116、SW620、SW480、SW-1116以及两类病人肿瘤组织在处于对数生长期时收集提取细胞中总蛋白，采用BCA法对总蛋白进行定量，然后通过SDS-PAGE电泳分离蛋白，再应用Bio-Rad公司的Quantityone软件对westernblot结果进行图像分析，比较相应蛋白条带的光密度值，结果显示ARPC4基因在几种结直肠癌细胞系中均有较高表达，但SW620细胞中相对表达水平最高(P＜0.05，p<0.05时认为差异具有统计学意义)(见图1)，因此选用人结直肠癌细胞系SW620进行后续操作。

3、将培养的SW620细胞分为阴性对照组(NC)、实验组(ARPC4-siRNA)和Control组(SW620)三组，在转染前一天，分别取处于对数生长期细胞消化计数后铺入6孔板内，次日，待细胞汇合度达到80％时，采用只含DMEM的培养基培养4h，然后按照Lipofetamin^TM2000说明书，分别转染48h，其结果见图2；其具体过程为：

(1)转染前一天，将细胞接种于500μL不含抗生素的培养基中培养，使其在转染时可生长至30～50％融合；

(2)制备转染液；

a、用50μL Opti-MeI低血清培养基或无血清培养基稀释步骤(1)中所述siRNA，轻轻混匀，使其浓度为66nM；

b、取1μL Lipofetamin^TM2000加入50μLOpti-MeI培养基中，室温孵育5min；

c、将步骤a和步骤b所得产物混合，轻轻混匀，室温放置20min，得转染液；

(3)向每孔细胞中分别加入制备得到的转染液，轻轻摇匀，37℃培养48h。

如图2所示，siRNA496、siRNA538和siRNA679在转染48h后，均对ARPC4具有抑制作用，其中，以siRNA538对其抑制效果最为明显，抑制率达到了87％(p＜0.05)。

检测项

1、CCK-8实验检测转染后的细胞增殖活性

分别取实验组(ARPC4-siRNA)和Control(SW620)组转染后生长状态良好的对数生长期细胞，胰酶消化后调整细胞密度至(1～3)×10⁴个/ml，100ul/孔接种于96孔板中，每组设置3个复孔，37℃、5％CO₂条件下培养过夜后，按照Lipofetamin^TM2000说明书步骤转染，分别在转染0d，1d、2d、3d和4d时，每孔加入10ul>

由CCK-8检测结果绘制细胞生长曲线(图4)可见，转染ARPC4-siRNA组的细胞增殖能力与空白对照组CCK-8法结果显示实验组和control组的细胞增殖差异不具统计学意义[(0.469±0.011vs0.507±0.007)，P＞0.05]，表明，通过siRNA抑制ARPC4基因并不能抑制结肠癌细胞的增殖。

2、流式细胞术检测细胞周期分布

分别收集实验组和对照组的SW620细胞1x10⁶个，分别用4℃预冷的PBS洗涤3次，然后70％冰乙醇固定后，置于4℃冰箱内过夜，次日再分别用PBS重悬洗涤2次，然后加入20μg/ml碘化丙啶(PI)和5ug/ml>

流式细胞仪分析结果显示(图5A～D)，实验组与control组相比，G0/G1期细胞所占比例(66.92％vs 66.80％)，S期细胞所占比例(20.71％vs 22.18％)，在G0/G1期及S期差异不具统计学意义(P＞0.05)，表明通过siRNA抑制ARPC4基因并不会影响结肠癌细胞的分裂。

3、Transwell实验检测细胞迁移能力

分别调整实验组、空白组和对照组的细胞密度至5×10⁵个/ml，每孔上室加200ul无血清该细胞悬液，下室加30％胎牛血清培养基450ul，常规培养48h后取出小室，PBS洗涤3次，用棉签擦去滤膜上层细胞，甲醇固定30min，2g/L结晶紫染色3min，10×40倍镜下观察滤膜下细胞并计数，每个样本随机计数3个视野，取平均数，其结果见图6。

由图6可知，在Transwell实验中，实验组的穿膜细胞数显著少于空白组和对照组。空白组和对照组穿膜细胞数分别为(60.6±2.07)和(50.0±1.58)，与实验组(20.4±1.14)相比较，差异具有统计学意义(p＜0.05)，可以由此推论，siRNA538将ARPC4沉默后，增加了SW620细胞的粘附性从而降低了它的侵袭与转移能力。

4、westernblot检测迁移和增殖相关基因的表达

提取实验组和对照组蛋白，以β-actin为内参，westernblot检测E-cadherin，vimetin和PCNA的表达水平，应用Bio-Rad公司的Quantityone软件对westernblot结果进行图像分析，比较相应蛋白条带的光密度值，其结果见图7A、图7B和图7C。

由图7A、B、C可知，迁移相关基因E-cadherin和viemetin的westernblot结果显示：实验组与对照组相比差异具有统计学意义[(51.9)vs(41.1)(25.04)vs(42.31)](p＜0.05]，而增殖抗原PCNA的westernblot结果显示实验组和对照组相比差异无统计学意义[(47.5)vs(45.3)，p＞0.05]。

综上所述，ARPC4-siRNA538转染SW620细胞后细胞的增殖能力变化不明显而侵袭能力明显减弱，实验组和对照组E-cadherin的表达相比明显升高，而vimetin的表达则相反，可以预测ARPC4基因可能通过增强vimetin的表达而抑制了E-cadherin表达，降低细胞之间的黏附性进而促进肿瘤细胞迁移侵润，参与肿瘤发生发展过程，表明，利用RNAi技术能够有效下调人结直肠癌SW620细胞中ARPC4的表达，减弱细胞的迁移侵袭，因次，特异性干预ARPC4基因的表达有可能成为基因治疗结直肠癌的一个新靶点。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学

<120> 通过沉默ARPC4基因来抑制人结直肠癌细胞增殖和迁移的siRNA及其应用

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