基质组蛋白新提取方法及小鼠肝纤维化基质组学的研究

摘要

背景：
　　以胶原蛋白为主的细胞外基质成分的过度沉积是肝纤维化的主要病理生理学特征。深入了解肝纤维化ECM白质的具体成分及动态变化对于研发新的肝纤维化诊疗技术具有重要意义。
　　目的：
　　开发更有效的基质组蛋白提取新方法，并应用该方法对人正常肝脏和小鼠肝纤维化模型进行基质组学研究，对人正常肝脏的基质组蛋白构成进行分析，鉴别小鼠肝纤维化发展和逆转过程中的差异蛋白，在“整体”基质组范围内研究肝纤维化的ECM成分及动态变化特征。最后通过免疫组织化学进一步验证相关蛋白的表达状况。
　　方法：
　　1.开发新的基质组蛋白提取方法，对人正常肝脏及基质组学成分进行分析。引入胶原酶，去糖基化酶及蛋白变性，Lys-C以及胰酶消化等步骤，开发ECM蛋白提取新方法，比较三种不同流程得出的基质组学数据，筛选最理想的流程作为进一步基质组学的研究方法；分析该流程获取的基质组学数据，研究人正常肝脏的基质组蛋白构成，免疫组法化对鉴定的特异蛋白进行验证。
　　2.小鼠肝纤维化模型的基质组学研究。构建小鼠BDL和CCL4动态肝纤维化动态模型。模型经天狼星红染色及胶原面积比例（collagen proportionate area，CPA）鉴定。应用蛋白组学技术检测各组提取的基质组蛋白，应用基于强度的绝对定量(intensity-based absolute quantification,iBAQ)分析各组的基质组蛋白构成；应用非标记定量（label free quantification,LFQ）分析各组差异蛋白，筛选不同阶段肝纤维化的重要蛋白并应用免疫组化进行鉴定。
　　结果：
　　1.基质组蛋白提取新方法：本研究发现按照胶原酶-去糖基化-蛋白变性-LysC和胰酶顺序的消化流程（C-D-U）可以鉴别出100种ECM（相关）蛋白，明显多于其它两个流程；该方法共鉴定出70种ECM核心蛋白，多于Hynes实验室的相关报道的62种。且本研究方法所鉴定出的COL2A1、COL4A4、COL4A5、COL5A3、COL21A1、BMPER、FBN2、IGFALS、LAMA2、LAMA3、LTBP4、MATN2、MFAP2、MFAP5、MFGE8及OGN均尚未被目前Hynes实验室建立的基质组学正常肝脏该数据库收录。显示本方法在提取ECM核心蛋白方面具有显著优势。
　　2.人正常肝脏的ECM成分构成及鉴定：胶原蛋白占总分子数量的91％，以COL1A1，COL1A2，COL3A1为主；糖蛋白占6%，以MFAP2，MFAP4，FBN1及EMILIN1等为主。蛋白聚糖占约2%，主要为BGN，DCN等。其它ECM相关蛋白约占1%。对COL21A1进行了免疫组织化学鉴定，发现其分布与COL1A1一致，主要表达于汇管区间质内和肝小叶中央静脉管壁。
　　3.小鼠肝纤维的基质组学研究：与sham组比较，BDL组和CCL4组肝组织经天狼星红染色及CPA定量分析各组胶原面积证明模型构建成功。各组共鉴定到12735个肽段，对应1346个蛋白，其中94个为基质组学蛋白，经统计学分析，BDL组与sham组比较，两组间差异表达蛋白总共49个，其中上调蛋白有44个，下调蛋白有5个。CCL44w
　　4.组与sham组比较，两组间差异表达蛋白共37个，其中上调蛋白31个，下调蛋白6个。CCL410w组与正常sham比较，两组间差异表达蛋白总共63个，其中上调蛋白有57个，下调蛋白有6个。CCL410w组与CCL44w组比较，两组间差异表达蛋白总共55个，其中45种上调，10种下调。CCL42AFD组与CCL410w组比较，两组间差异表达蛋白总共有24个，其中上调蛋白有4个，下调蛋白有20个。生物信息学分析进一步提示，这些差异蛋白中包括多种FACIT家族，SLRPs家族和丝氨酸水解酶抑制剂家族成员以及Col18a1等其它基质组蛋白，这些蛋白很可能通过不同机制参与肝纤维化的发展和逆转。我们对三个SLRPs蛋白(Aspn、Prelp及Kera)进行了免疫组化鉴定，结果与基质组学数据基本一致。
　　结论：
　　1.我们开发的基质组蛋白提取新方法可以提取更多基质组核心蛋白，较之基质组领域权威Hynes实验室的方法有一定优势，符合进一步基质组学的要求。
　　2.对人正常肝脏基质组蛋白的构成有了更深入的认识，人正常肝脏COL21A1的分布与COL1A1一致。
　　3.在肝纤维化模型中筛选和鉴定出大量差异蛋白，其中一部分，尤其是SLRPs家族可能是与肝纤维化发展或逆转有关的重要候选蛋白。

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前言

第一部分 细胞外基质蛋白提取新方法及正常人肝脏基质组学的研究

材料与方法

一、正常肝组织标本

二、实验材料与试剂

三、 实验方法

结果

1. 三种ECM消化溶解方法的比较。

2. 人正常肝脏ECM蛋白的非标记定量分析

3. 免疫组化验证质谱分析结果并观察COL21A1蛋白在正常肝组织的表达定位

4. 所鉴定基质蛋白的相互作用关系网络

讨论

第二部分 小鼠肝纤维化的基质组学研究

材料与方法

一、小鼠肝纤维化模型

二、实验材料与试剂

三、实验方法

结果

1. 胶原染色评估各组纤维化模型

2. 各组基质组学成分非标记定量分析

3. 各组特异蛋白比较

4．利用LFQ筛选各组间差异蛋白

5. 免疫组织化学分析

讨论

参考文献

全文结论

综述:细胞外基质与肝纤维化

附录

缩略词表

致谢