内质网E3泛素化连接酶Hrd1在B细胞发育和活化中的作用及机制研究

摘要

Hrd1，又名synoviolin，属于E3泛素链接酶。它位于内质网膜上，其N端含有亲水性的六次穿膜结构域，位于胞浆中的C端含有RING-H2结构域和脯氨酸富含域。RING-H2结构域是Hrd1作为E3连接酶的催化活性结构域，而脯氨酸富含域极有可能作为一个蛋白-蛋白相互作用的结合位点而募集胞浆中待泛素化的蛋白。
　　早期的研究主要发现Hrd1可以识别、泛素化和转运靶蛋白而参与内质网相关蛋白降解途径，这条途径可以及时清除内质网腔内的折叠错误的蛋白，从而可以对合成的蛋白进行质量控制和维持内质网的稳态。之后的研究发现Hrd1不止可以泛素化折叠错误的蛋白而介导它们的降解，它还可以降解其它非折叠错误的蛋白从而参与到细胞的众多生物学过程中。例如在DC细胞中，Hrd1可以泛素化Blimp1介导其降解来促进DC细胞的抗原提成功能，在神经元细胞中通过靶向淀粉样前蛋白抑制神经元变性。有研究报道，在体外细胞系中，Hrd1可以泛素化未折叠的Igμ和未被糖基化的Igκ链，这提示Hrd1可能通过泛素化生理条件下的这两个分子来调控B的发育和免疫。为此，我们运用B细胞系特异性Hrd1敲除小鼠模型来研究生理条件下Hrd1对B细胞的影响。
　　目的：较为系统、全面地分析生理条件下Hrd1对B细胞发育分化、功能的影响及其生理/病理意义。解析Hrd1调控B细胞的分子机制。
　　方法：运用流式技术分析Hrd1-/-小鼠和WT小鼠B细胞亚群的组成、凋亡和增殖；用多种刺激源在体外活化B细胞，用T细胞依赖或非依赖性免疫方法免疫小鼠，然后运用流式技术仪检测 B细胞的活化、凋亡、增殖和浆细胞分化，ELISA检测抗体水平；运用各种分子生物学方法进一步研究Hrd1对B细胞调控的分子机制。
　　结果：通过对骨髓和脾脏中 B细胞发育各个阶段的细胞和各亚群细胞进行分析后，我们发现相对于正常小鼠，在骨髓中，Hrd1-/-large pre-B细胞比例增多、small pre-B减少、循环成熟B细胞减少；在脾脏中，Hrd1-/-小鼠总B细胞比例减少。通过体内或体外活化成熟 B细胞，我们发现相对于 WT组，Hrd1-/-小鼠的 B细胞活化后凋亡增多。进一步研究发现，一旦Hrd1被敲除，pre-BCR复合物和Fas分别在pro/preB细胞和活化的外周B细胞中积聚。后续的分子生物学实验证明它们作为Hrd1的底物被Hrd1泛素化，从而被蛋白酶体降解，所以Hrd1的缺失导致了它们在细胞中被累积。
　　意义：本研究发现Hrd1通过泛素化pre-BCR和Fas，在两个关节点调控了B细胞发育和活化。pre-BCR在pre-B细胞中的正常下调是pre-B细胞和后续B细胞发育成熟的必要条件。研究报道 pre-BCR介导的信号转导可以负反馈下调pre-BCR的表达，然而其它的pre-BCR下调机制则鲜有报道。本研究首次发现Hrd1可以在转录后水平调节preBCR，从而调控影响B细胞的发育。Fas介导的活化诱导的凋亡可以下调免疫反应和清除自身性反应 B细胞。目前对Fas转录水平的调控已有大量文献报道，然而对其转录后的调控则了解甚少。在本研究中，我们发现在活化的B细胞中Hrd1可以在转录后水平调控Fas。这些结果提示E3泛素连接酶可以作为B细胞调控因子的调控因子来参与B细胞的发育分化及功能。

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第一部分 实验材料与方法

1 实验材料

1.1 实验动物

1.2 试剂与耗材

1.3 质粒、细胞系和抗体

1.4 相关引物

1.5 主要实验仪器与耗材

2 实验方法

2.1 细胞的复苏、培养和传代及冻存

2.2 质粒的转化和小量抽提

2.3 总RNA抽提

2.4 cDNA的制备

2.5 质粒构建

2.6 基因组DNA抽提

2.7 淋巴细胞的单个悬浮细胞制备骨髓单个悬浮细胞的制备

2.8 细胞染色及流式细胞仪检测1）淋巴单个细胞悬浮液制备

2.9 细胞增殖实验

第二部分 Hrd1敲除小鼠模型建立及其表型分析

引言

结果

小结

第三部分 Hrd1对B细胞发育、分化和成熟影响的研究

引言

结果

小结

第四部分 Hrd对B细胞活化诱导的凋亡影响的研究

引言

结果

小结

第五部分 讨 论

参考文献

泛素化和去泛素化酶在免疫系统中的调控作用研究进展

1.1 泛素化/去泛素化过程

1.2 泛素化酶系统

1.3 泛素化模式及其作用

1.4 E3s识别、选择底物的机制

1.5 免疫系统

2.1 泛素化对TLRs信号通路的调控

2.2 泛素化对RLR信号通路的调控

2.3 泛素化对NLR信号通路的调控

2.4 泛素化对TNF信号通路的调控

3.1 泛素化/去泛素化对T细胞的调控

3.2 泛素化/去泛素化对B细胞的调控

参考文献

博士期间完成的论文

附录

致谢