腺病毒介导的ING4/p53双基因治疗乳腺癌的协同抑瘤效应及其机制研究

摘要

目的：探讨腺病毒介导的ING4/p53双抑癌基因治疗乳腺癌的疗效及其机制。
　　方法：
　　1.分别以pAdTrack-CMV/ING4质粒和p53 ORF克隆质粒为模板，PCR扩增ING4（BglII、SalI）和 p53（XhoI、XbaI）目的片段，分别亚克隆至 pAdTrack-CMV/polyA+hEF1a-eIF4g转移载体构建pAdTrack-CMV/ING4/polyA+
　　hEF1a-eIF4g/p53双基因共表达重组转移载体。
　　2.将构建正确的 pAdTrack-CMV/ING4/polyA+hEF1a-eIF4g/p53重组转移载体经PmeI酶切后与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒在BJ5183大肠杆菌中进行同源重组，得到的同源重组质粒 pAdEasy-1-pAdTrack-CMV/ING4/polyA+hEF1a-eIF4g/p53（简称为pAd-ING4/p53）经PacI酶切后再用脂质体转染HEK-293细胞，经多轮感染、扩增、纯化后获得AdVING4/p53双基因共表达重组腺病毒载体。
　　3.利用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）和建立裸鼠人乳腺癌皮下移植瘤模型检测AdVING4/p53对MDA-MB-231乳腺癌细胞体外、BALB/c裸鼠体内生长的影响。
　　4. Annexin V-PE/7-AAD双染法流式细胞仪（FCM）和 TUNEL法分别检测AdVING4/p53在体外、BALB/c裸鼠体内诱导MDA-MB-231乳腺癌细胞凋亡的作用。
　　5. Western blot检测AdVING4/p53对MDA-MB-231乳腺癌细胞p53、乙酰化p53、P21、Bax、PUMA、Noxa、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3和PARP表达的影响；免疫组化检测AdVING4/p53对BALB/c裸鼠MDA-MB-231乳腺癌皮下移植瘤p53、乙酰化p53、P21、Bax、PUMA、Noxa、Bcl-2、剪切型Caspase-3和CD31表达的影响。
　　结果:
　　1.成功构建了 pAdTrack-CMV/ING4/polyA+hEF1a-eIF4g/p53重组转移质粒和pAd-ING4/polyA+hEF1a-eIF4g/p53同源重组腺病毒质粒，及获得了ING4和p53的双基因共表达重组腺病毒AdVING4/p53。
　　2. AdVING4/p53有效地介导了 ING4和 p53在 HEK-293人胚肾细胞、MDA-MB-231人乳腺癌细胞中的转基因和共表达。
　　3.腺病毒介导的ING4和p53双基因共表达（AdVING4/p53）在体外、BALB/c裸鼠体内均能明显抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞生长和诱导凋亡，并且具有协同效应。
　　4. AdVING4/p53具有增强上调 MDA-MB-231乳腺癌乙酰化 p53、P21、Bax、PUMA、Noxa、剪切型Caspase-9、剪切型Caspase-3、剪切型PARP和下调Bcl-2的效应。
　　5. AdVING4/p53具有协同下调MDA-MB-231乳腺癌移植瘤CD31的表达和降低肿瘤微血管密度的作用。
　　结论：腺病毒介导ING4和p53双基因治疗乳腺癌很可能通过ING4促进p53的乙酰化和转录活性来增强活化内源性凋亡途径、协同抑制肿瘤血管新生，进而产生协同的抑瘤效应。

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英文摘要

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研究背景

参考文献

第一部分 ING4和p53双基因共表达重组腺病毒的构建和鉴定

1 材料和方法

2 结 果

3 讨 论

参考文献

第二部分 AdVING4/p53对MDA-MB-231乳腺癌细胞抑瘤作用的研究

1 材料和方法

2 结 果

3 讨 论

参考文献

综述;乳腺癌基因治疗的研究进展

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