Wnt/β-ca质tenin下游靶基因Nedd9调节间充干细胞迁移的机制研究

摘要

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）免疫原性低，具有多向分化潜能，普遍存在脊椎动物的脐带、骨髓以及脂肪等组织中，获取方便，来源充足，便于实现自体细胞移植，可以作为细胞移植治疗的种子细胞。在长期培养过程中，MSCs始终保持其多向分化的潜能，包括向神经细胞的分化。在神经退行性疾病治疗过程中，由于MSCs迁移至损伤部位的细胞数量有限，给治疗带来了极大不便，因此提高MSCs的迁移能力对治疗有着重要意义。
　　Wnt信号通路可以调节多种细胞生命活动，包括细胞的增殖、分化和迁移等过程。Wnt/β-catenin信号通路的核心是β-catenin入核与转录因子TCF结合进而启动下游靶基因的转录。我们实验室研究发现 Wnt/β-catenin信号的激活能够促进MSCs的迁移。Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因是如何调控细胞的迁移，此类研究报道较少。Wnt/β-catenin的下游靶基因Nedd9（neural precursor cell expressed，developmentally down regulated9）是一类黏着斑支架蛋白可以调控黏着斑的周转。据报道，在肿瘤细胞中，Nedd9的表达可以响应 Wnt/β-catenin的变化，并影响肿瘤细胞的浸润和侵袭。本文是围绕 Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因Nedd9对MSCs迁移的影响展开研究。
　　首先分离得到SD大鼠骨髓来源的MSCs，作为实验所需的细胞材料。通过Boyden chamber装置进行群体细胞迁移分析实验，结果显示用50 ng/ml的经典Wnt信号配体Wnt3a处理MSCs，与对照组相比MSCs的迁移能力提高1.6倍，相反用5μM的Wnt/β-catenin抑制剂FH535处理后，MSCs的迁移能力下降至对照组的60％。实验结果表明，Wnt/β-catenin信号通路的激活能够促进MSCs的迁移。与此同时，Wnt/β-catenin信号通路的激活可以提高 Nedd9的表达。高表达Nedd9是否同样促进MSCs的迁移，将在本课题中进行研究。
　　我们以SD大鼠cDNA为模版克隆全长Nedd9，构建高表达Nedd9的重组腺病毒（Adenoverus，Ad）载体质粒，线性化后转入QBI-293A中进行包装和扩增，并筛选出可以感染MSCs的最适腺病毒感染复数。通过Boyden chamber装置进行群体细胞迁移分析实验，结果显示，与Ad组相比，感染Ad-Nedd9后细胞群体水平的机动性迁移能力显著性提高。据报道，MSCs表达HGF（Hepatocye growth factor）的受体c-met，体外实验表明HGF可以促进MSCs的迁移。我们以HGF作为趋化性因子研究MSCs的趋化性迁移，结果发现与Ad组相比，感染Ad-Nedd9后的细胞群体水平向HGF的趋化性迁移能力显著性的提升。同时我们发现，高表达Nedd9后，HGF处理与未处理组相比迁移的细胞数目没有显著性变化。此外，通过Dunn chamber装置，从单细胞水平研究高表达Nedd9的MSCs向HGF趋化性迁移与Ad组相比，细胞的迁移速率明显提高而迁移效率没有显著性变化。
　　MAPKs(Mitogen-activated protein kinases)信号与细胞迁移密切相关。我们实验室发现，Wnt/β-catenin信号的激活能增强MSCs的迁移能力，并且对MAPKs信号有相应的激活。那么高表达Nedd9是否也能相应地激活MAPKs信号？接下来，我们研究了Nedd9调控MSCs迁移的分子机制，通过Western blot实验检测高表达Nedd9和感染Ad的MSCs中Stress-activated protein kinases(SAPK)/Jun amino-terminal kinases(JNK)、ERK1/2（extracellular regulated protein kinases）、p38/MAPK总蛋白及其磷酸化水平的变化，发现它们的总蛋白水平及ERK1/2和p38/MAPK的磷酸化水平没有改变，而SAPK/JNK的磷酸化水平在高表达Nedd9的MSCs中显著性提高。
　　黏着斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）和桩蛋白（paxillin）都是黏着斑相关蛋白，对黏着斑的形成和周转有着重要作用，前面介绍到，Nedd9是一类黏着斑支架蛋白，有文献报道，在一些肿瘤细胞中 Nedd9可以调节 FAK或 paxillin的活性。因此我们通过Western blot检测黏着斑相关蛋白FAK和paxillin总蛋白及其磷酸化的变化。发现，在MSCs中高表达Nedd9，FAK和paxillin总蛋白及FAK的酪氨酸397位点（Y397-FAK）磷酸化水平并没有变化，而paxillin的Y118位点（Y118-paxillin）的磷酸化水平比 Ad组显著性提高。由于细胞迁移与黏着斑周转和细胞骨架重排密切相关，利用免疫荧光染色检测 Nedd9对 MSCs黏着斑的形成及分布、细胞骨架重排的影响。发现高表达 Nedd9后，黏着斑总数增多，且向细胞周边分布，并且影响了微丝骨架的重排。
　　体外实验发现高表达 Nedd9可以促进 MSCs的迁移。接着我们检测 Nedd9在体内能否促进MSCs向损伤部位的迁移。我们通过构建了大鼠T10脊髓全横断损伤模型，造模7 d后，鞘注法进行细胞移植，再经过7 d后，取损伤部位脊髓进行冷冻切片，追踪移植的细胞在脊髓损伤部位前后的分布并计数。发现，感染Ad-Nedd9的MSCs定植到损伤部位的细胞数比感染Ad组的显著增多。
　　综上所述，Wnt/β-catenin信号通路的激活促进MSCs迁移，同时提高其下游靶基因Nedd9的表达。为了研究Wnt/β-catenin信号通路促进MSCs的迁移是否通过其下游靶基因Nedd9的作用。我们构建了Nedd9的重组腺病毒载体，检测高表达Nedd9同样可以促进MSCs的迁移。本研究初步揭示了Wnt/β-catenin信号通路促进MSCs迁移的分子机制，为MSCs未来应用与临床移植治疗提供了理论基础。

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序言

参考文献

第一部分 Wnt/β-catenin信号通路促进MSCs的迁移且影响其下游靶基因Nedd9的表达

1. 实验材料

2. 实验方法

3. 实验结果

4. 讨论

参考文献

第二部分 Nedd9重组腺病毒载体的构建与鉴定

1. 实验材料

2. 实验方法

3. 实验结果

4. 讨论

参考文献

第三部分 Wnt/β-catenin信号下游靶基因Nedd9促进MSCs的迁移

1. 实验材料

2. 实验方法

3. 实验结果

4. 讨论

参考文献

结论

综述：细胞迁移的分子机制

缩略表

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