胱硫醚γ裂解酶/硫化氢通路在同型半胱氨酸诱导的巨噬细胞炎症中的作用及机制研究

摘要

第一部分胱硫醚γ裂解酶/硫化氢通路在同型半胱氨酸诱导的巨噬细胞炎症中的作用
　　目的：观察高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia，HHcy）小鼠模型中炎症因子、硫化氢（Hydrogen sulfide，H2S）、胱硫醚γ裂解酶（Cystathionineγ-lyase，CSE）的表达水平，及CSE/H2S通路对同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）诱导的巨噬细胞炎症的影响。
　　方法：在体实验以 C57BL/6小鼠为研究对象，用2％（w/v）蛋氨酸饮水建立高同型半胱氨酸血症模型。C57BL/6小鼠随机分为对照组、蛋氨酸组、蛋氨酸+GYY4137（H2S缓释剂）组、蛋氨酸+PAG（CSE抑制剂）组。造模两周后处死动物，使用同型半胱氨酸测定试剂盒检测血浆中Hcy浓度；亚甲蓝法检测血浆中H2S水平；ELISA检测炎症因子肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）及白细胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）表达；Quantitative PCR、western blot法分别检测小鼠原代腹腔巨噬细胞CSE mRNA及蛋白表达。
　　离体实验以小鼠源性巨噬细胞系 Raw264.7细胞为研究对象，分别用 Hcy、GYY4137、PAG处理细胞。亚甲蓝法检测细胞培养上清中 H2S水平；ELISA检测TNF-α、IL-1β水平。
　　结果：与对照组相比，蛋氨酸组C57BL/6小鼠血浆中Hcy水平显著升高（P<0.01）；血浆促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β）水平显著升高（P<0.001）；血浆H2S水平显著下降（P<0.05）。并且蛋氨酸处理组的小鼠腹腔巨噬细胞中H2S合成酶CSE的 mRNA和蛋白表达分别减少60%和45%。GYY4137（50 mg/kg/day,皮下注射）可以减少蛋氨酸饮食的小鼠血浆中促炎细胞因子TNF-α与IL-1β的表达，而PAG（37.5 mg/kg/day,皮下注射）则增加蛋氨酸饮食的小鼠血浆中促炎细胞因子TNF-α与IL-1β的表达。皮下注射GYY4137与PAG对蛋氨酸饮食小鼠的血浆Hcy水平没有影响。
　　在Raw264.7细胞中，100μM Hcy抑制细胞中H2S的生成并促进TNF-α与IL-1β的生成。GYY4137可呈剂量依赖性地改善Hcy诱导的TNF-α与IL-1β的生成。半胱氨酸为 H2S合成所需的底物，当给予半胱氨酸（1 mM）预处理，Raw264.7细胞受Hcy刺激产生的TNF-α和IL-1β明显减少，而该作用能被PAG（1 mM）逆转。在没有半胱氨酸预处理情况下，PAG对Hcy诱导的促炎细胞因子TNF-α与IL-1β的生成没有明显影响。
　　结论： CSE-H2S通路的下调可能参与了Hcy诱导的巨噬细胞炎症反应的发生。
　　第二部分同型半胱氨酸对巨噬细胞中CSE/H2S通路的影响及其机制
　　目的：研究Hcy对巨噬细胞中CSE/H2S通路的影响及其潜在的机制。
　　方法：采用western blot及Q-PCR分别检测Hcy对Raw264.7细胞中CSE的蛋白及mRNA表达的影响；应用荧光素酶活性检测试剂盒检测Hcy对cse启动子活性的影响；分别用Q-PCR、DNA甲基化转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）活性试剂盒检测Hcy对DNMT的mRNA表达及酶活性的影响；用亚硫酸盐测序法检测Hcy对cse启动子区甲基化的影响；分别用基因敲减及药物干预的方法处理Raw264.7细胞，检测DNMT在Hcy抑制CSE表达中的作用。
　　结果：Hcy抑制Raw264.7细胞中CSE的蛋白、mRNA表达及启动子活性；Hcy上调Raw264.7细胞中DNMT mRNA表达水平及酶活性，并增强cse启动子区的甲基化；用siRNA干扰或者抑制剂处理DNMT可以逆转Hcy对CSE表达的抑制作用。
　　结论：Hcy通过促进cse启动子区甲基化抑制CSE的转录从而下调CSE-H2S通路。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

前言

参考文献

第一部分 胱硫醚γ裂解酶/硫化氢通路在同型半胱氨酸诱导的巨噬细胞炎症中的作用

1引言

2 材料和方法

3结果

4讨论

参考文献

第二部分 同型半胱氨酸对巨噬细胞中CSE/H2S通路的影响及其机制

1 引言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

参考文献

结论

综述: 硫化氢与动脉粥样硬化的发病机制

中英文对照缩略词表

攻读学位期间公开发表的论文及科研成果

致谢